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标  题: 生物大分子三维结构的测定方法
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生物大分子三维结构的测定方法

董国刚 09811036

指导教师：程虎民 教授

[摘要]：生物大分子结构的测定方法是限制分子生物学发展的关键技术，本文主要介绍了
三种方法：X射线单晶衍射技术、核磁共振技术、扫描隧道显微技术以及它们的优缺点和发
展情况。
[关键词]：生物大分子结构 X射线单晶衍射技术 NMR技术 STM技术

    生物大分子结构和功能的研究是生物大分子化学的重要课题。大量实验表明，生物大
分子的功能不仅与其一级结构有关，而且与其三维空间结构有关。要了解酶的催化机理，
要懂得基因表达调控中的分子相互作用，要解释膜的输运，肌肉的收缩以及免疫机制，无
一不要从生物大分子空间结构的角度去了解。完整、精确、实时（动态）的测定生物大分
子三维结构的主要研究对象包括核酸、蛋白质、寡糖、脂以及它们之间的复合物。目前主
要采用的研究方法有：X射线单晶衍射分析、扫描隧道显微技术（STM）和原子力显微技术
（AFM）以及计算机和资料分析技术等。下面将主要介绍其中的几种。

一、X射线单晶衍射分析

1、晶体学知识
    一切晶体，其内部的原子（分子、离子）总是按照一定的方式在三维空间作有规律的
重复排列。这些重复单位称为晶体结构的基元。晶体中由无限多个基元抽象出来的无限多
个点在空间沿三维方向排列，构成了一组按一定周期重复的点群，即点阵。所以我们可以
认为晶体结构=点阵+结构基元,将点阵点方式连接起来，在空间就形成了一个六面体，即晶
格。晶体的空间点阵可以划分为一族族平行等间距的平面点阵。在晶体点阵中任取一点阵
点为原点O，取晶胞的平行六面体单位的三个边为坐标轴（x, y, z），以晶胞相应的三个
边长a, b, c分别为x, y, z 上的单位长度，则有一平面点阵与坐标轴相交，截距为r, s,
 t，我们用 (1/r ):(1/s):(1/t)=h: k: l来表示这一平面点阵，即晶面指标（h, k, l）
。由于(1/nr): (1/ns): (1/nt)= s: t: l 。所以一个晶面指标（h, k, l）代表一族互相
平行的平面点阵。

2、X射线衍射基本原理
    用于晶体结构分析的X射线波长范围在0.5-2.5A之间，与晶面间距的数量级相当，因此
，晶体可以作为X射线的天然衍射光栅。设波长为λ的X射线入射到两个互相平行的点阵面
(h, k, l) 上，则由衍射条件可以得到：

    散射角θ’=入射角θ ………………………………………………………………………
…①
     ……………………………………………………………………………②

d h ,k, l 为相邻两平面点阵的间距，式②称为Bragg 方程，是理解晶体对X射线衍射的最
基本方程。公式表明，在用晶面指标（h, k, l）表示的平面点阵族中每一点阵面都是反射
面，且当相邻点阵平面上的原子在衍射X射线时所产生的光程差等于波长的整数倍nλ时，
将产生衍射极大值。
    原子在某一方向上散射波的振幅用原子散射因子f 表示。f随sinθ/λ增加而减少（θ
为散射角，λ为波长）。设晶胞中有n个原子，第j个原子在晶胞中分数坐标为(x j, y j,
 z j)，则：

     …………………………………………………③

F h, k, l 称结构因子。上式可写作:

      ………………………………………………………………………④
│F h, k, l│为结构振幅，其平方正比于衍射强度，αh k l为相角。

3、X射线衍射分析步骤及方法
    用X射线衍射分析生物大分子结构时，必须完成以下步骤：
    ⑴ 用实验测定单个晶格的线度，从衍射图中测量很大一部分衍射点的强度。
    ⑵ 从上述数据中，结合其他方法，推断其原子排列，得出尝试结构模型。
    ⑶ 修正所提出的模型，直至计算出的和实际中所得到的数据趋向于符合。
    测定生物大分子的晶体结构，必须选用单晶衍射法。以测定蛋白质结构为例，首先要
培养出足够大（约1mm长）的蛋白质单晶。一般用溶剂的微扰法使蛋白质在结构完整的状态
下析出。获得了好的晶体后，就可以正式收集衍射强度，可以采用照相法或衍射仪法。再
用间接的方法确定相角αh k l。通常采用同晶置换法，即把重原子（强散射体）引入结晶
蛋白质分子中，要求重原子既不改变蛋白质分子的构象，又不改变结晶形式，从而制得同
晶形重原子衍生物。然后利用其衍射图推算出重原子在晶胞中的位置，求出相角αh k l 
。这样，结构因子F h, k, l 即可被确定下来。从而可计算出空间某一点的电子密度，画
出电子密度图，电子密度图的极值中心就是原子的位置。

4、单晶衍射法的优缺点及发展
    X射线单晶衍射分析迄今仍然是蛋白质和核酸空间结构测定的主要方法。正是由于这种
技术的应用促进了分子生物学的建立和发展。现在的X射线晶体结构分析正努力在第四维时
间坐标上跟踪、分辨和描述大分子的结构变化，即所谓的思维结构测定。解决这一问题的
手段之一是将X射线晶体衍射与低温生化结合起来。这是由于温度每降低10℃，反应速率约
减少一半。若温度降低至－50℃左右，反应速率就大大降低了，本来不稳定的中间反应物
相对而言就稳定了。另一方法是利用同步辐射所提供的很强的X射线源，可在3秒内收集全
部衍射数据，使得在以秒记的时间范围内的动态结构测定成为可能。这种方法是生物大分
子晶体学最有希望的发展趋势之一。由于其波长连续可变，故可利用晶体内金属原子吸收
两侧反常散射数据差别大这一特点解决相角问题。
    我们知道，相位角是不能在衍射图上直接得出的。这是因为，首先，X射线频率（101
8Hz）极高，为决定一个相位我们一定要能完全、精确的监测它，这就需要一个能对在10－
18s内电场变化作出反应的相位记录仪器。这是目前我们无法做到的；其次，我们还要能够
监测一给定波相对于参比波的相位。这样，我们要知道衍射波之点与参比波之点的相对距
离。为使其有意义，对这个距离测定的精确度必须比单个X射线波长小很多，也就是要有一
把精确测量到10－13m尺子。这也是我们做不到的；再次，目前的X射线源都是非相干源，
各入射波之间没有明确的相位关系。所以，由于我们缺少这样三件仪器：一个时间反应能
力很快的检测器、一把精度很高的尺子和一个相干X射线源，使我们无法直接观测到相角。
由于这些都只是技术上的原因，而非原理上的问题， 随着物理学的发展，这个问题或许会
有解决的一天。
    X射线面临的困难仍有许多，其中最困难的一步就是获得好的晶体。由于对蛋白质单晶
生长缺乏内在的规律性的认识，使单晶培养具有很大的不确定性。

    到这里我们或许会想到，既然人们对细胞的认识是从显微镜开始的，为什么不可以使
用X射线显微镜来直接观测大分子的结构？这是因为，目前还没有什么方法可以使X射线聚
焦，即没有X 射线透镜，也就没有X射线显微镜。

二、核磁共振技术（NMR）

1、简单原理：
    自旋量子数（I）不为零的原子核，自旋且带有电荷，因此产生磁距。在外加磁场中，
将会相对于磁场取向，同时发生能级分裂。各能级之间有能量差，低能态的核可以吸收能
量而跃迁至高能态，这就是核磁共振。原子核外围的电子云在外加磁场（H0）中，产生感
生磁场，致使原子核实际感受的磁场（H）变小，为使该核发生共振，必须适当增加H0，以
抵消电子云的屏蔽作用。这种磁场强度的移动称为化学位移。根据它可以考查原子核所处
的化学环境，从而对化合物进行结构分析。共振谱线的能量差称为自旋耦合常数，以J表示
。J是NMR中极重要的参数，与H0无关，与分子结构有关，与键数、键的性质、成键核的数
目和自旋、溶液中的构象等都有关系。

2、特点、意义、及其前景
    核磁共振技术（NMR）是生物学研究中非常重要的分析手段。由于NMR的非破坏性，用
NMR研究完整组织受到广泛重视，可根据NMR谱图确定其成分的存在和浓度，这是其它方法
难以胜任的。NMR法研究蛋白质三维结构有许多超出X射线衍射法之处。NMR法可以在水溶液
中或有机相中研究生物大分子结构。由于绝大多数生物大分子至今无法得到单晶，X射线衍
射法无能为力，但NMR技术却可以对这类分子进行空间结构研究。NMR法还可以研究溶液条
件如PH、温度、离子强度等的改变对生物大分子空间构型的影响，观察生物大分子的变性
过程与空间结构的关系，研究生物大分子间的相互作用与空间结构的关系。NMR技术还可以
研究生物大分子内部的动力学特征。

三、扫描隧道显微技术（STM）

1、原理
    扫描隧道显微镜的基本原理利用量子力学中的隧道效应，将原子线度的极细探针和被
研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近时（通常小于1nm），在外加
电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极，这种现象就是隧道效应。

    隧道电流I是电子波函数重叠的量度，与针尖和样品之间的距离S和平均函数Φ有关：


        ………………………………………………………………………⑤

Vb是加在针尖和样品之间的偏置电压，平均功率函数Φ≈1/2×（Φ1+Φ2），Φ1和Φ2分
别是样品和针尖的功函数。A为常数，真空条件下约等于1。被观测样品应具有一定导电性
才可以产生隧道电流。
    由上式可知，隧道电流强度对针尖与样品表面距离非常敏感。因此，利用电子反馈线
路控制隧道电流恒定，并用压电陶瓷材料控制针尖在样品表面扫描，则探针在垂直于样品
方向上高低变化就反映出了样品表面的起伏。将针尖在样品表面扫描时运动的轨迹直接在
荧光屏或记录纸上显示出来，就得到了样品表面态密度的分布或原子排列的图象。

2、STM的优越性及其局限性
    STM技术在核酸结构、蛋白质和酶的结构、生物膜结构以及超分子水平的生命结构的研
究中取得了一系列成果。它的优越性具体表现为：
    ⑴ STM能够在较高分辨水平上观察样品的实三维表面结构。STM具有原子级高分辨率，
在平行和垂直于样品表面方向的分辨率分别可达0.1nm和0.01nm，即可分辨出单个原子。
    ⑵ STM可适用于不同的探测环境，使在生命的天然条件下或准天然条件下对生物样品
的结构进行直接的观察成为可能。
    ⑶ STM可改变观测范围，为研究各种不同层次的生命结构提供了可能。
    这些独特的优点，为STM在生命科学领域尤其是生物大分子结构研究中的应用展示了广
阔的前景。但是，仍存在许多亟待解决的问题：
    ⑴ 基底的选择 高定向石墨（HOPG）是STM在研究生物分子时常用的基底，但研究表明
，它会对 DNA等分子产生干扰。所以，能否尽快找到合适的基底材料，或者建立一种行之
有效的能区分生物分子和基底特征的实验方法，是影响STM下一步在生物体系中应用的关键
。
    ⑵ 样品的导电性 只有在导电性较好的样品与针尖之间才能形成隧道电流，而生物样
品一般具有较底的导电性能。但只要吸附在导电基底上的生物样品足够薄，或者是在潮湿
的条件下对样品进行观察，是能够获得裸露生物样品表面图象的，但导电性很差的生物大
分子样品的成像理论还有待进一步的探讨。
    ⑶ 样品的固定 若只是以简单的物理吸附方法把样品分散在基底表面，由于针尖与样
品之间的相互作用，样品会随针尖扫描而在基底表面移动，不能形成稳定的、真实的图象
。
    ⑷ 样品的柔软性 一般的生物大分子样品都不是刚性结构。在STM成像中，针尖与样品
的相互作用以及样品的热振动，可能造成样品表面结构的改变。
    ⑸ 图象的识别、认定与解释 目前，对于所获得的STM的图象的解释，尚没有一套完整
的理论。至今用STM所获得的绝大多数都是已知结构的生物大分子的观察结果，用STM获得
全新的结构信息，则寥寥无几。

　

    生物大分子三维结构的测定方法，直接促进了分子生物学的建立及发展，并衍生了一
些边缘学科。X射线单晶衍射技术已经发展成为较成熟的技术并且还在不断的取得新的进展
，相信在未来较长的一段时间内仍是测定结构的主流方法。NMR法及STM法则已经显示出其
潜在的优势，尽管由于技术的原因，NMR法至今仍无法普遍应用，但已经成功的测定了一些
相对分子量在2万以下的蛋白质和核酸片段的空间结构，随多维核磁共振技术的发展，NMR
法很有可能取代X射线衍射技术而成为测定生物大分子结构的主流技术。但每种方法都有其
一定的局限性，所以，将各种方法有机的结合起来联合测定生物大分子的结构，将成为发
展方向之一。终有一天，生物大分子的结构被人们较为清楚的得到，那时，人类将对生命
的奥秘有更深的了解。

　

[参考文献]

程虎民 结构化学与结构分析基础（北京大学生化专业用讲义），130-180
[美] D.舍伍德 晶体、X射线和蛋白质 科学出版社，1985：419-421
李家瑶 生物大分子结构与功能 （王亚辉等主编）走向二十一世纪的生物学 未来生物学（
1991-2020）预测，1992：41-54
刘次全 白春礼 张静 结构分子生物学 高等教育出版社，1997：272-298
白春礼 扫描隧道显微术及其应用 上海科学技术出版社，1992：9-14，185-188
诗蕴渝 二维核磁共振波谱研究蛋白质和核酸的溶液构象 （惠永正等主编）化学与生命科
学，化学工业出版社，1991，438-440



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