Biology 版 (精华区)

发信人: uwm (waiting...), 信区: Biology
标  题: PNAS: Duke大学庄元:用一种新的染色体免疫沉淀方法找
发信站: 哈工大紫丁香 (Fri Nov 15 09:54:11 2002) , 转信


Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99, Issue 23, 15030-15035, November 12, 2002

 
Immunology
Identification of E2A target genes in B lymphocyte development by using a gene
 t
agging-based chromatin immunoprecipitation system 

Stephen Greenbaum and Yuan Zhuang* 
Department of Immunology, Duke University Medical Center, Box 3010, Durham, NC
 2
7710 

Edited by Mark T. Groudine, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, W
A,
 and approved September 16, 2002 (received for review May 17, 2002) 


    Abstract 
 
The transcription factors encoded by the E2A gene are known to be essential fo
r 
B lymphocyte development, and ectopic expression or gene inactivation studies 
ha
ve revealed several potential lineage-specific E2A target genes. However, it r
em
ains unknown whether these target genes are directly regulated by E2A at the t
ra
nscriptional level. We therefore generated mice carrying an affinity-tagged E2
A 
knock-in allele to provide a system for the direct elucidation of E2A target g
en
es based on E2A binding to target regulatory regions. Abelson-transformed pre-
B 
cell lines derived from these mice were used in chromatin immunoprecipitation 
ex
periments to identify regulatory sequences bound by E2A in the context of an e
ar
ly B lymphocyte environment. Significant E2A binding was detected at the promo
te
rs and enhancers of several essential B-lineage genes, including the Ig intron
ic
 and 3' enhancers, 5 and VpreB surrogate light chain promoters, the EBF locus 
pr
omoter region, and the mb-1 (Ig) promoter. Low levels of E2A binding were obse
rv
ed at several other lymphoid-restricted regulatory regions including the Ig he
av
y chain (IgH) intronic enhancer, the IgH 3' enhancers hs3b/hs4, the RAG-2 enha
nc
er, and the 5' regions of the B29 and TdT loci. An E2A target gene, the predic
te
d butyrophilin-like gene NG9 (BTL-II), was also identified by using a chromati
n 
immunoprecipitation-based cloning strategy. In summary, our studies have provi
de
d evidence that E2A is directly involved in the transcriptional regulation of 
a 
number of early B-lineage genes. 


    Introduction 
Top 
Abstract 
Introduction 
Materials and Methods 
Results 
Discussion 
References  
The development of lymphocytes from hematopoietic stem cells involves a series
 o
f highly regulated differentiation events that depend on the collaborative eff
or
ts of a number of transcription factors. These transcription factors coordinat
el
y regulate lymphopoiesis through the initiation, maintenance, and restriction 
of
 lineage-specific gene expression programs. The transcription factors encoded 
by
 the E2A gene are known to play critical roles in the regulation of lymphocyte
 d
evelopment. E2A proteins are highly expressed in developing lymphoid cells (1,
 2
), and gene targeting studies have shown that E2A proteins are required for th
e 
initiation of B cell development in the bone marrow. Mice deficient in E2A dem
on
strate a complete and persistent block at the earliest stage of B cell develop
me
nt before the initiation of Ig heavy chain gene rearrangements, as well as a d
ra
matic reduction in thymocyte number (3, 4). 

The mammalian E2A gene encodes two major products, E12 and E47, which are memb
er
s of the basic helix-loop-helix (bHLH) family of transcription factors (5, 6).
 b
HLH proteins are characterized by a conserved HLH dimerization domain and an a
dj
acent basic region that mediates DNA binding (7, 8). E12 and E47 are generated
 b
y alternative splicing of adjacent exons encoding their bHLH domains and bind 
th
e consensus E-box sequence CANNTG as homodimers or as heterodimers with other 
bH
LH transcription factors (5-7, 9, 10). As E-box binding factors, E12 and E47 a
re
 members of a subfamily of bHLH transcription factors denoted the E proteins (
9)
. The E protein family also includes the transcription factors E2-2 and HeLa E
-b
ox binding protein (HEB), which play important roles in lymphocyte development
 a
s well (11-14). 

E2A proteins were initially characterized for their binding activity at the Ig
 h
eavy and light chain enhancers, which were subsequently shown to contain sever
al
 functionally relevant E2A binding sites (10, 15-18). Ectopic expression of E2
A 
in non-B cells was also found to induce germ-line Ig transcription and rearran
ge
ment, suggesting that E2A might play a key role in Ig gene regulation (19-21).
 M
ore recent studies demonstrated that transfection of the kidney cell line BOSC
23
 with E2A and the RAG recombination machinery was sufficient to drive diverse 
re
combination events at the Ig heavy and light chain loci (22, 23). Overexpressi
on
 studies have also implicated E2A in the regulation of other genes involved in
 t
he initiation and maintenance of the B cell developmental program. Ectopic exp
re
ssion of E12 in a macrophage line was shown to result in the induction of the 
B-
lineage transcription factors EBF and Pax5/BSAP, as well as IL-7R and RAG-1 (2
4)
. Other potential E2A targets include several components of the pre-B cell and
 B
 cell receptor (BCR) complexes, including the surrogate light chains 5 and Vpr
eB
 and the BCR signaling molecules mb-1 (Ig) and B29 (Ig) (25, 26). However, it 
re
mains unclear whether the lineage and stage-specific expression of these genes
 i
s directly regulated by E2A at the transcriptional level or, alternatively, is
 a
ctivated by other factors downstream of E2A. 

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) strategies have recently been used for mo
re
 direct assessments of target gene regulation based on transcription factor bi
nd
ing to suspected regulatory regions. For example, ChIP has been successfully u
se
d in the verification and cloning of several E2F target genes in human cell li
ne
s (27). In yeast, ChIP-based analysis of transcription factor binding to relev
an
t target sequences has been facilitated by the introduction of affinity tags t
o 
endogenous proteins by homologous recombination (28). We have therefore combin
ed
 an in vivo murine gene-tagging approach with a ChIP assay to investigate both
 s
uspected and novel E2A target genes in lymphoid cells. Mice carrying a dual af
fi
nity-tagged E2A knock-in allele have been generated and used to derive pre-B c
el
l lines that express a functional E2A fusion protein. This fusion protein prov
id
es a means for highly efficient immunoprecipitation of E2A-bound DNA fragments
, 
which have been screened for the presence of several suspected E2A target sequ
en
ces. We have used this approach to identify a subset of B-lineage genes whose 
re
gulatory regions are bound by E2A under physiological conditions, providing ev
id
ence for direct transcriptional regulation of these genes by E2A. The pre-B ce
ll
 lines expressing affinity-tagged E2A have also been used in ChIP-based clonin
g 
of a previously uncharacterized E2A target gene. 


    Materials and Methods 
Top 
Abstract 
Introduction 
Materials and Methods 
Results 
Discussion 
References  
E2AFH Knock-In Mice. 

The E2AFH gene-targeting construct was generated by using an E2A genomic seque
nc
e isolated from the 129/sv strain. A 2-kb genomic fragment of homologous seque
nc
e was used in subcloning to create an in-frame fusion of the E2A carboxyl term
in
us with oligonucleotides encoding the following amino acid sequence: Ala-Gly-A
sp
-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Ala-Gly-His-His-His-His-His-His-Stop. A phosphogl
yc
erate kinase promoter-driven neomycin resistance cassette (PGK-Neo) was insert
ed
 into a unique XbaI site downstream of the E2A poly(A) signal and between the 
ho
mologous segments for positive selection of clones undergoing homologous recom
bi
nation. A PGK promoter-driven thymidine kinase (PGK-TK) cassette was placed ou
ts
ide of the homologous targeting sequences to allow for negative selection agai
ns
t random nonhomologous recombination events. The final targeting construct was
 l
inearized and transfected into embryonic stem cells by electroporation. Transf
ec
ted clones were cultured under double selection with gancyclovir and G418, and
 c
orrect targeting of 27 of 95 clones was determined by PCR screening. Germ-line
 t
ransmission was obtained from one of two injected clones, and mice carrying th
e 
E2AFH allele were maintained in a specific pathogen-free environment at Duke U
ni
versity's animal facility. 

Derivation of Abelson Pre-B Cell Lines. 

Abelson murine leukemia virus (AMLV) was prepared as supernatant from ABO10 ce
ll
s, pretreated with polybrene, and added to E2AFH/FH or E2Aloxp/loxp bone marro
w 
cells cultured in RPMI 1640 media supplemented with 10% FBS, penicillin/strept
om
ycin, -ME, and gentamycin. After 3 wk, bulk cultures were subcloned to yield t
he
 Abelson lines E2AFH1B, E2AFH4, and E2Aloxp 1AB1. 

Chromatin Extracts and Immunoprecipitations. 

Cells were fixed and washed for preparation of chromatin extracts essentially 
as
 reported by Fernandez et al. (29). Fixed cells were then sonicated (Fisher Sc
ie
ntific 550 tapered microtip probe, setting 4) for 20-25 cycles of 25 s on a co
ld
 block with 15 s cooling between each burst, to obtain 0.5- to 1.0-kb DNA frag
me
nts. Sonicates were centrifuged at 14,000 × g for 5 min, and supernatants wer
e 
harvested and stored at 80°C. ChIP procedures were adapted from those describ
ed
 by Fernandez et al. (29). Chromatin extracts (1-2 mg) from the E2AFH1B pre-B 
ce
ll line or the untagged control cell line AMLV-3B (derived from C57BL/6 bone m
ar
row) were diluted 1:10 in ChIP buffer (140 mM NaCl/100 µg/ml BSA/100 &mi
cr
o;g/ml yeast tRNA/1% Triton X-100/1 mM PMSF) and incubated with 50 µl of
 a
nti-FLAG agarose for 2 h at 4°C, rotating slowly. The bound agarose beads wer
e 
harvested by centrifugation (14,000 × g for 15 s) and washed three times in 1
 m
l of IP buffer, twice in 1 ml of IP buffer containing 500 mM NaCl, twice in 1 
ml
 of wash buffer (10 mM Tris·HCl, pH 8.0/250 mM LiCl/1 mM EDTA), and three tim
es
 in 1 ml of TE buffer (10 mM Tris·HCl, pH 8.0/1 mM EDTA). Bound DNA was elute
d,
 incubated at 65°C overnight to reverse cross-links, and then RNase-treated, 
de
proteinized, and precipitated as described by Fernandez et al. (29). Processed
 D
NA fragments were resuspended in 100 µl of distilled water. Cloning of i
mm
unoprecipitated DNA fragments was performed essentially as described by Weinma
nn
 et al. (27). 

PCR Screening of Suspected Target Genes. 

A series of 4-fold dilutions of input chromatin and immunoprecipitated DNA fro
m 
E2AFH and control cell lines was PCR-amplified for 29-32 cycles (94°C, 1 min;
 5
8°C, 1 min; 72°C, 1min; with 2 min final extension at 72°C) in 20 µl 
PC
R buffer containing 3 mM MgCl2 and Platinum Taq polymerase (Invitrogen). The e
nt
ire PCR samples were then resolved on 1.5% agarose gels and visualized by ethi
di
um bromide staining. Relative band intensity was used in qualitative compariso
ns
 of target sequence enrichment from ChIPs of E2AFH vs. untagged control cell l
in
es. All oligonucleotides used in PCR screening of immunoprecipitated DNA were 
23
-mers (IDT DNA) designed to amplify 150- to 200-bp regions surrounding potenti
al
 E2A-binding sites within the regulatory regions of suspected target genes (Ta
bl
e 1, Regulatory region and Clone). In some cases, multiple primer sets were us
ed
 to cover larger genomic sequences and potential regulatory regions; represent
at
ive results for each of these regions are presented in Fig. 4. 




                              
View this table: 
[in this window]
[in a new window]
   Table 1.   Oligonucleotide primer pairs used for ChIP-PCR screening of puta
ti
ve E2A target genes (Regulatory region), ChIP-PCR enrichment confirmation of c
lo
nes isolated as E2A-bound sequences (Clone), and RT-PCR analysis of Abelson ce
ll
 line transcripts (Transcript) 
 
 



    Results 
Top 
Abstract 
Introduction 
Materials and Methods 
Results 
Discussion 
References  
Generation of Affinity-Tagged E2AFH Mice. 

We wanted to use a ChIP strategy to elucidate target genes that are directly r
eg
ulated by E2A during lymphocyte development. Because the efficiency of immunop
re
cipitation-based studies can be limited by antibody specificity or affinity, w
e 
used an in vivo gene-tagging approach in generating an affinity-tagged E2A kno
ck
-in mouse model to facilitate the isolation of endogenous E2A-bound DNA sequen
ce
s. Oligonucleotides encoding dual affinity tags were cloned into the 3' exon o
f 
the genomic E2A locus such that both E12 and E47 would be expressed as fusion 
pr
oteins carrying carboxyl-terminal FLAG epitope and hexahistidine sequences (Fi
g.
 1A). Proper targeting of the locus with the knock-in allele was confirmed by 
So
uthern blotting (Fig. 1B) and PCR genotyping (Fig. 1C). Bands representing the
 e
xpected wild-type and E2AFH alleles were detected, and normal distributions of
 e
ach genotype were observed, indicating that the knock-in allele did not have a
n 
effect on neonatal survival. 





View larger version (25K): 
[in this window] 
[in a new window]
   Fig. 1.   Generation of dual affinity-tagged E2A knock-in allele. (A) Wild-
ty
pe E2A locus and E2A-FLAGHis knock-in allele containing in-frame fusion of 3' 
E2
A exon sequence with FLAG and hexahistidine affinity tags. (B) Southern blot g
en
otyping confirmation of BamHI-digested tail DNA from E2AFH/+ intercross pups. 
A 
1.3-kb PCR-generated genomic E2A probe was used to detect the wild-type and kn
oc
k-in alleles. (C) PCR genotyping of intercross pups by using YZ-104 (E2A antis
en
se), YZ-29 (Neo sense), and YZ-164 (E2A sense) primers (31). 
 
 


E2AFH Fusion Protein Supports Normal Lymphocyte Development. 

B lymphocyte development is highly dependent on E2A protein dosage, such that 
ev
en a 50% reduction in E2A protein activity translates into altered B cell deve
lo
pment in the bone marrow (4, 13, 30). We therefore wanted to investigate B-lym
ph
opoiesis in E2AFH mice as a sensitive indicator of E2A fusion protein expressi
on
 and function. Fluorescence-activated cell sorter (FACS; Becton Dickinson) ana
ly
sis of bone marrow and splenocytes from wild-type, E2AFH/+ heterozygous, and E
2A
FH/FH homozygous mice showed that lymphocyte development was normal in the kno
ck
-in mice. The E2AFH allele led to no significant alterations in the relative p
er
centages or numbers of pro- and pre-B cell populations (Fig. 2A) and mature Ig
M+
 B cell populations in the bone marrow (Fig. 2B). Normal B and T lymphocyte pr
of
iles were also observed in the spleen (Fig. 2 C and D) and thymus, and other h
em
atopoietic populations in the bone marrow and spleen were also normal (data no
t 
shown). The fusion protein was therefore expressed from the targeted locus and
 w
as functional in supporting normal lymphocyte development. 





View larger version (44K): 
[in this window] 
[in a new window]
   Fig. 2.   Normal lymphocyte development in E2AFH mice. Bone marrow (A and B
) 
and splenocytes (C and D) from 3-wk-old wild-type (E2AWT/WT), heterozygous (E2
AF
H/WT), and homozygous (E2AFH/FH) littermates were analyzed by FACS for express
io
n of lymphocyte lineage surface markers by using the following fluorescent ant
ib
ody conjugates: IgM-FITC, B220-APC, CD19-PE, CD4-FITC, and CD8-APC (Caltag, So
ut
h San Francisco, CA); and CD43-PE (PharMingen). (A) Bone marrow staining for B
22
0 and CD43. (B) Bone marrow staining for B220 and surface IgM. (C) Splenocyte 
st
aining for B220 and surface IgM. (D) Splenocyte staining for CD4 and CD8. 
 
 


Abelson-Transformed Pre-B Cell Lines Express Functional E2AFH Fusion Protein. 


To establish a culture system for studying E2A target sequences in the context
 o
f an early B cell environment, bone marrow was isolated from E2AFH/FH mice and
 t
ransformed with AMLV. The Abelson virus encodes the v-Abl oncogene and selecti
ve
ly targets developing pre-B cells for transformation. Primary transformants we
re
 established from E2AFH/FH bone marrow cultures, and two subcloned lines, E2AF
H1
B and E2AFH4, were then derived for subsequent studies. These lines, as well a
s 
an untagged control Abelson line (E2Aloxp 1AB1) generated from the bone marrow
 o
f mice carrying a loxp-flanked E2A knock-in allele (E2Aloxp/loxp), displayed a
 t
ypical B220+CD19+ pre-B cell phenotype (Fig. 3A; ref. 31). Anti-FLAG immunopre
ci
pitations of E2A from nuclear extracts from E2AFH1B or E2AloxP control cells w
er
e then performed to verify the expression and functional utility of the E2AFH 
fu
sion proteins. An anti-E2A Western blot of the immunoprecipitated extract conf
ir
med that the fusion proteins were expressed and that affinity purifications co
ul
d be performed by using the FLAG epitope tag (Fig. 3B). A band corresponding t
o 
the molecular mass of the immunoprecipitated E2A fusion protein (74 kDa) was a
ls
o detected by colloidal staining of an SDS/PAGE gel (Fig. 3C). Electrophoretic
 m
obility-shift analysis of nuclear extracts from the three Abelson clones (E2AF
H1
B, E2AFH4, and E2AloxP) indicated that the E2A fusion protein bound to a &micr
o;
E5 E-box oligonucleotide probe as expected and that the E2AFH-DNA complex coul
d 
be mobility-shifted with anti-FLAG antibody (Fig. 3D). 





View larger version (45K): 
[in this window] 
[in a new window]
   Fig. 3.   Characterization of Abelson-transformed pre-B cell lines. (A) FAC
S 
analysis for expression of B-lineage markers CD19 and B220 on E2AFH clone 1B, 
E2
AFH clone 4, and E2Aloxp control clone 1AB1. (B) Anti-E2A (G193-86, PharMingen
) 
Western blot of elution fractions from anti-FLAG agarose affinity-purification
 o
f primary E2Aloxp and E2AFH/FH transformant nuclear extracts (*, E2A monomer).
 (
C) Colloidal Coomassie staining of FLAG peptide elution fractions from affinit
y-
purification of subcloned Abelson lines. E2A monomer (*) is indicated, as well
 a
s a specific higher-molecular-weight band representing a commonly observed alt
er
native isoform or modification of E2A. (D) Electrophoretic mobility-shift anal
ys
is on Abelson pre-B nuclear extracts for binding to radiolabeled µE5 oli
go
nucleotide (10). E2A in µE5-binding complexes unshifted (*) or supershif
te
d (**) with 1 µl of anti-FLAG antibody. 
 
 


E2A Is Bound to a Subset of Lineage-Restricted Regulatory Regions. 

Phenotypic and biochemical analysis of the E2AFH Abelson lines demonstrated th
at
 the E2A fusion protein was expressed, displayed normal DNA-binding characteri
st
ics in vitro, and could be immunoprecipitated with anti-FLAG antibody. The aff
in
ity-tagged protein should facilitate efficient immunoprecipitation of E2A-boun
d 
DNA sequences from cross-linked chromatin fragments. Chromatin extracts were t
he
refore prepared from the E2AFH1B or untagged control cell lines, and E2A-bound
 D
NA fragments were obtained by anti-FLAG immunoprecipitation. These sequences w
er
e then screened for enrichment of promoter and enhancer regions within several
 p
otential lymphoid-restricted E2A target genes. Unfractionated input chromatin 
an
d immunoprecipitated DNA from the E2AFH1B cell line and an untagged control ce
ll
 line (AMLV-3B) were PCR-amplified by using primers surrounding the E-box site
s 
within the regulatory elements of these genes (Table 1, Regulatory Region). Co
mp
arisons of the relative signals observed after amplification of immunoprecipit
at
ed DNA from tagged vs. control chromatin extracts allowed for qualitative dete
rm
inations of whether each potential target sequence was enriched due to E2A bin
di
ng. 

Significant enrichment was observed for several suspected E2A targets, includi
ng
 the Ig intronic and 3' enhancers, the mb-1 (Ig) promoter, the 5 and VpreB pro
mo
ters, and the 5' region of the EBF locus (Fig. 4A). Selective enrichment of th
es
e regulatory regions indicated E2A protein binding and suggested that E2A is l
ik
ely to play a direct role in the transcriptional regulation of these genes dur
in
g B cell development. Interestingly, several other potential E2A target sequen
ce
s appeared to be only slightly enriched in the ChIP-PCR screen, including the 
Ig
H intronic and hs3b/hs4 3' enhancers, the RAG-2 enhancer, and the 5' regions o
f 
the B29 and TdT loci (Fig. 4B). Meanwhile, no enrichment was observed for seve
ra
l other potential E2A targets, including the IgH 3' enhancer hs3a and the prom
ot
er sequences for Pax5, RAG-1, RAG-2, Oct-2, CD5, and CD19 (Fig. 4C). The obser
va
tion that only a subset of putative E2A targets was actually enriched provided
 s
upport for both the selectivity and relevance of the assay because enrichment 
re
quired more than just an accessible locus containing potential E2A binding sit
es
. 





View larger version (91K): 
[in this window] 
[in a new window]
   Fig. 4.   ChIP-PCR screen for E2A binding to regulatory regions of potentia
l 
target genes. A series of 4-fold dilutions of input chromatin and immunoprecip
it
ated DNA from E2AFH1B or untagged control pre-B cell lines were PCR-amplified 
by
 using primers specific for suspected E2A target regions (see Table 1, Regulat
or
y region). Sequence enrichment in immunoprecipitated DNA from E2AFH1B vs. cont
ro
l chromatin indicated E2A binding within genomic region. Each experiment was r
ep
eated at least three times, and results shown were reproducible for all target
s.
 (A) Significant enrichment of the Ig enhancers, 5 and VpreB promoters, 5' EBF
 l
ocus, and mb-1 promoter was observed. (B) Low levels of enrichment were seen f
or
 the IgH intronic and hs3b/hs4 enhancers, 5' B29 and TdT loci, and RAG-2 enhan
ce
r. (C) No enrichment was indicated for the Pax5, CD19, Oct-2, RAG-1, RAG-2, an
d 
CD5 promoters and the IgH hs3a enhancer. 
 
 


Identification of Novel E2A Target Genes by ChIP-Based Cloning. 

Comparative PCR analysis provided a means for qualitative assessment of enrich
me
nt (and thus E2A binding) at a suspected target sequence. However, the regulat
or
y regions identified as E2A targets by ChIP-PCR screening probably represent o
nl
y a small subset of all genes subject to transcriptional regulation by E2A dur
in
g B cell development. A more general approach was required to broaden the scop
e 
of the study to include the identification of novel E2A target genes. ChIP-bas
ed
 cloning strategies have recently been used in identifying novel target genes 
re
gulated by ubiquitous transcription factors such as E2F (27). We therefore use
d 
our E2AFH pre-B cell ChIP system for the cloning and characterization of novel
 E
2A target sequences. Immunoprecipitated DNA fragments from E2AFH1B chromatin e
xt
racts were blunt-ended by polymerase treatment and ligated into pBluescript ve
ct
or. The transformed clones were then screened by restriction digest, and 13 of
 2
4 clones were found to contain inserts representing immunoprecipitated DNA fra
gm
ents. These inserts were sequenced by using vector-specific primers, and the s
eq
uences obtained were then identified by BLAST or ENSEMBLE database searches fo
r 
mouse genome matches. Ten of 13 sequences had single murine genome matches, wh
er
eas the remaining 3 yielded either no match or multiple genomic matches (Table
 2
). Sequence analysis of the 10 genomic clones indicated that 9 of 10 inserts c
on
tained at least one E box representing a potential E2A binding site. Important
ly
, eight of these nine sequences were subsequently found to be enriched by ChIP
-P
CR screening, providing strong confirmation that the majority of DNA fragments
 i
solated by ChIP-based cloning represented actual E2A-bound sequences (Table 1,
 C
lone; Table 2). Interestingly, seven of the eight sequences found to be enrich
ed
 by ChIP-PCR were also located within predicted or known gene loci (Table 2). 





                              
View this table: 
[in this window]
[in a new window]
   Table 2.   Summary of inserts isolated as E2A-bound sequences from ChIP-bas
ed
 cloning of novel E2A target genes 
 
 


The ChIP-1 insert yielded a perfect match to an intronic sequence of the putat
iv
e mouse butyrophilin-like gene NG9 (BTL-II), located within the extended MHC I
I 
locus (GenBank accession no. AF050157.1). The 428-bp sequence also contained t
wo
 E-box sites, including one canonical E2A binding site, CAGGTG (Fig. 5A). The 
ge
nomic region represented by the ChIP-1 clone was therefore selected for furthe
r 
analysis. Primers (I) specific for the sequences flanking the prominent ChIP-1
 E
 box were used to confirm E2A-dependent enrichment of the region by PCR (Fig. 
5 
A and B). Because the clone represented intronic sequence between central exon
s 
of the gene, two additional primer sets (II, III) were also designed to screen
 f
or enrichment of the putative promoter region of NG9. A fourth primer pair (IV
) 
covering what was speculated to be a nonregulatory region upstream of the firs
t 
NG9 exon was used in ChIP-PCR screening as well. Interestingly, the genomic re
gi
ons corresponding to both the ChIP-1 clone and the putative NG9 promoter regio
n 
were moderately enriched in immunoprecipitated DNA from E2AFH1B chromatin (Fig
. 
5C). No significant enrichment of the nonregulatory region represented by prim
er
 pair IV was observed, supporting the specificity of the enrichment seen with 
th
e other primers. 





View larger version (72K): 
[in this window] 
[in a new window]
   Fig. 5.   E2A target gene isolated by ChIP-based cloning. Immunoprecipitate
d 
DNA fragments from E2AFH1B chromatin extract were cloned, sequenced, and ident
if
ied by mouse genome database search (see Table 2). (A) ChIP-1 clone insert wit
h 
an exact match to an intronic region within the putative butyrophilin-like gen
e 
NG9. Clone-specific primers (I; in italics) surrounding the consensus E box (C
AG
GTG) were used to confirm E2A binding by ChIP-PCR. (B) Primers to the ChIP-1 i
ns
ert (I), the predicted promoter region (II and III) of the NG9 locus, and a re
gi
on upstream of the transcription start site (IV). (C) ChIP-PCR screen for E2A 
bi
nding at the ChIP-1 insert genomic sequence and NG9 5' regulatory regions. (D)
 S
emiquantitative RT-PCR analysis of four 3-fold dilutions of E2AFH1B cDNA for t
he
 predicted NG9 transcript, along with relevant B-lineage genes (Ig, 5, I&micro
;)
 and a loading control (EF1) (see Table 1, Clone). Thirty cycles (21 cycles fo
r 
EF1) of PCR amplification (94°C, 30 s; 57°C, 30 s; 72°C, 30 s, with 1 min e
xt
ension at 72°C) were performed in PCR buffer containing 3 mM MgCl2 and Platin
um
 Taq polymerase (Invitrogen). 
 
 


The NG9 gene contains several conserved domains characteristic of the butyroph
il
in gene family, including two Ig variable-like (IgV) domains and two Ig consta
nt
 region-like (IgC) domains (Fig. 5A) (32). No functional information on the ge
ne
 product is available, however, and little is known about its expression in ly
mp
hoid cells. Because E2A was shown to bind to putative regulatory regions of NG
9 
and typically functions as a positive regulator of transcription, we wanted to
 e
valuate NG9 transcription in the cells from which the ChIP clone was isolated.
 c
DNA from E2AFH1B cells was therefore PCR-amplified by using primers specific f
or
 the 5' and 3' regions of the predicted NG9 transcript, as well as primers to 
se
veral other B-lineage genes (Table 1, Clone). NG9 transcripts were detectable 
in
 E2AFH1B cells along with Ig, 5, and Iµ transcripts, further supporting 
a 
role for E2A in the regulation of NG9 expression (Fig. 5D). 


    Discussion 
Top 
Abstract 
Introduction 
Materials and Methods 
Results 
Discussion 
References  
To our knowledge, there have been no previous studies in which an in vivo muri
ne
 gene-tagging approach has been used to facilitate analysis of target genes re
gu
lated by an endogenously expressed transcription factor. The gene-tagging syst
em
 provides a distinctive alternative to the use of ectopically expressed protei
ns
 and also bypasses the challenges of low antibody affinity and specificity tha
t 
can sometimes interfere with traditional protein isolation approaches. Similar
ly
, to our knowledge there have been no previous studies to directly characteriz
e 
E2A binding to a number of lymphoid lineage-restricted regulatory regions at t
he
 chromatin level. Here, we have demonstrated E2A binding to regulatory regions
 w
ithin a select subset of genes required for B lymphocyte development. Previous
 e
ctopic expression and promoter-analysis studies have implicated E2A in the reg
ul
ation of many of these target genes, including the Ig heavy and  light chains,
 s
urrogate light chains 5 and VpreB, and the transcription factor EBF (22, 24, 2
6)
. Significant enrichment of these sequences by E2A-ChIP provides more conclusi
ve
 evidence for direct transcriptional regulation by E2A. Binding of E2A to 5' r
eg
ulatory regions within the EBF locus is also in agreement with recent studies 
by
 Smith et al. (33), who have characterized a potential E2A binding site within
 t
he newly identified EBF promoter region. We were also intrigued to see strong 
en
richment of the mb-1 (Ig) promoter region, because this observation provided d
ir
ect evidence for the regulation of yet another component of the B cell recepto
r 
complex by E2A. Although mb-1 has been implicated as a potential E2A target in
 g
enetic studies, it has generally been considered a primary target for other tr
an
scription factors, such as Pax5/BSAP, Ets, and Oct-2 (34, 35). However, our da
ta
 on E2A binding to the mb-1 promoter supports unpublished work by Hagman et al
. 
demonstrating occupation of an mb-1 promoter E-box site by DNA footprinting an
al
ysis (J. Hagman, personal communication). These studies provide further insigh
t 
into the collaborative regulation of gene expression by E2A and other transcri
pt
ion factors during B-lymphopoiesis. 

We consistently observed that certain regulatory regions (Ig enhancers, mb-1 p
ro
moter, 5' EBF locus, and 5 and VpreB promoters) are significantly enriched aft
er
 E2A-DNA immunoprecipitations, whereas other putative targets (IgH intronic an
d 
hs3b/hs4 enhancers, 5' TdT and B29 loci, and RAG-2 enhancer) show only very lo
w 
levels of enrichment. We have also evaluated a group of lymphoid lineage-restr
ic
ted genes that show no detectable enrichment in our ChIP-PCR assay, including 
th
e IgH 3' enhancer hs3a and the promoters for Pax5, RAG-1, RAG-2, CD19, Oct-2, 
an
d CD5. The lack of enrichment of these sequences further substantiates the spe
ci
ficity of the ChIP-PCR system as a means for elucidation of direct vs. indirec
t 
E2A target genes. Although the transcription of these genes has been shown to 
be
 affected by E2A activity, previous studies have provided no significant evide
nc
e for direct transcriptional regulation by E2A. Our data suggests that Pax5/BS
AP
, Oct-2, CD19, and RAG-1 may be targets for transcriptional regulation by othe
r 
genes downstream of E2A. This possibility is supported by previous observation
s 
that ectopic expression of EBF in a macrophage line leads to activation of a s
ub
set of E2A-responsive genes including Pax5 (24). E2A-mediated activation of th
e 
EBF locus may therefore play a role in establishing the hierarchy of transcrip
ti
on factors at the earliest stages of B-lymphopoiesis, with EBF subsequently co
nt
ributing to the induction of Pax5 and other downstream genes. 

Perhaps the most surprising data obtained from the ChIP-PCR screen were the mi
ni
mal enrichment observed for the IgH enhancers. The presence of abundant I&micr
o;
 transcripts in the pre-B cell lines indicates that the IgH locus is accessibl
e 
and transcriptionally active. The IgH enhancers also contain well-characterize
d 
E-box sites, which are required for normal Ig gene transcription and rearrange
me
nt (15, 18). However, previous transfection and DNase hypersensitivity studies
 h
ave shown that only one of the 3' IgH enhancers, hs4, is thought to be active 
at
 the early stages of B cell development (36, 37). Interestingly, hs4 was the m
os
t prominently enriched of the 3' enhancers, with its most proximal enhancer, h
s3
b, showing slightly lower enrichment. No detectable enrichment of IgH enhancer
 h
s3a was observed, which is in agreement with previous data suggesting that thi
s 
enhancer is only functional in activated mature B cells (reviewed in ref. 37).
 H
ere, we must also emphasize that a lack of significant E2A binding at any give
n 
regulatory region in the pre-B cell lines does not exclude the possibility of 
di
rect transcriptional regulation by E2A. Alternatively, certain regulatory regi
on
s may be bound by E2A only at restricted developmental stages during B cell de
ve
lopment and/or activation. This caveat may be particularly relevant in the ana
ly
sis of genes involved in Ig rearrangement, such as RAG-1 and RAG-2, TdT, and t
he
 Ig genes themselves. The tight and highly ordered developmental regulation of
 t
hese loci during B-lymphopoiesis may involve significant E2A binding only duri
ng
 specific phases of Ig gene rearrangement, assembly, and expression. Future st
ud
ies on E2A-bound regulatory regions in primary cells at different stages of de
ve
lopment should provide further insight on these dynamic regulatory processes. 


A ChIP-based cloning strategy was used to isolate several novel E2A-bound sequ
en
ces, including an intronic region within the novel E2A target gene NG9 (also k
no
wn as BTL-II for butyrophilin-like MHC class II-associated). E2A binding at E-
bo
x-containing genomic regions across this locus was subsequently investigated b
y 
sequence analysis and ChIP-PCR screening. The NG9 locus lies downstream from t
he
 E locus and upstream from a cluster of other butyrophilin-like genes within t
he
 extended MHC II locus (32). As with other butyrophilin genes, each conserved 
do
main of NG9 is encoded by a separate exon, providing support for the notion th
at
 the butyrophilin gene clusters arose through exon shuffling and duplication. 
Ho
wever, NG9 lacks both the transmembrane domain and the conserved carboxyl-term
in
al B30.2 domain of the traditional butyrophilins. Interestingly, sequencing da
ta
 from multiple cell lines indicates that the NG9/BTL-II locus is also highly p
ol
ymorphic with respect to HLA haplotype (32). These polymorphisms translate int
o 
at least five different NG9 alleles and may have been generated and maintained
 d
uring the diversification of the MHC/HLA loci. Although NG9 transcripts have p
re
viously been detected in skeletal muscle and a number of gut tissues, to our k
no
wledge no previous work has evaluated potential regulatory regions and charact
er
ized NG9 transcription specifically in lymphoid cells (32). A number of other 
po
tential target sequences were also isolated by ChIP-based cloning, most of whi
ch
 appear to be bona fide E2A-bound targets based on their enrichment and their 
lo
cation within known or predicted gene loci. The ChIP-PCR screening strategy us
ed
 in characterizing E2A binding at the NG9 locus should also prove quite useful
 i
n evaluating these and other large genomic regions for transcription factor bi
nd
ing in vivo. In future studies, we will be combining the ChIP-based cloning sy
st
em with gene array analysis on E2A-deficient cell lines to characterize additi
on
al E2A target genes. This powerful two-tiered approach will allow for the eluc
id
ation of target genes based on both E2A binding and the requirement for E2A in
 t
he normal expression of these genes. 


    Acknowledgements 

We are grateful to Cheryl Bock at the Duke University Transgenic Mouse Facilit
y 
for her work in generating the E2AFH mice. We also thank Michael Krangel at Du
ke
 University for equipment use and critical review of the manuscript, William F
or
rester at Harvard University for providing the ABO10 viral producer line, and 
Ma
rco Davila at Duke University for donating the control Abelson line AMLV-3B. T
hi
s work was supported by a research grant from the National Cancer Institute (R
O1
 CA72433) and a scholarship from the Leukemia and Lymphoma Society to Y.Z. 


    Abbreviations 

bHLH, basic helix-loop-helix; ChIP, chromatin immunoprecipitation; AMLV, Abels
on
 murine leukemia virus. 


    Footnotes 

* To whom correspondence should be addressed. E-mail: yzhuang@duke.edu. 


This paper was submitted directly (Track II) to the PNAS office. 


    References 
Top 
Abstract 
Introduction 
Materials and Methods 
Results 
Discussion 
References  

1.  Jacobs, Y. , Vierra, C. & Nelson, C. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 7321-7333
[A
bstract].  
2.  Xin, X. , Nelson, C. , Collins, L. & Dorshkind, K. (1993) J. Immunol. 151,
 5
398-5407[Abstract/Free Full Text].  
3.  Bain, G. , Maandag, E. R. , Izon, D. J. , Amsen, D. , Kruisbeek, A. M. , W
ei
ntraub, B. C. , Krop, I. , Schlissel, M. S. , Feeney, A. J. , van Roon, M. , e
t 
al. (1994) Cell 79, 885-892[ISI][Medline].  
4.  Zhuang, Y. , Soriano, P. & Weintraub, H. (1994) Cell 79, 875-884[ISI][Medl
in
e].  
5.  Murre, C. , McCaw, P. S. & Baltimore, D. (1989) Cell 56, 777-783[ISI][Medl
in
e].  
6.  Sun, X. H. & Baltimore, D. (1991) Cell 64, 459-470[ISI][Medline].  
7.  Murre, C. , McCaw, P. S. , Vaessin, H. , Caudy, M. , Jan, L. Y. , Jan, Y. 
N.
 , Cabrera, C. V. , Buskin, J. N. , Hauschka, S. D. , Lassar, A. B. , et al. (
19
89) Cell 58, 537-544[ISI][Medline].  
8.  Voronova, A. & Baltimore, D. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4722-47
26
[Abstract].  
9.  Ephrussi, A. , Church, G. M. , Tonegawa, S. & Gilbert, W. (1985) Science 2
27
, 134-140[ISI][Medline].  
10.  Murre, C. , Voronova, A. & Baltimore, D. (1991) Mol. Cell. Biol. 11, 1156
-1
160[ISI][Medline].  
11.  Bain, G. , Gruenwald, S. & Murre, C. (1993) Mol. Cell. Biol. 13, 3522-352
9[
Abstract].  
12.  Hu, J. S. , Olsen, E. N. & Kingston, R. E. (1992) Mol. Cell. Biol. 12, 10
31
-1042[Abstract].  
13.  Zhuang, Y. , Cheng, P. & Weintraub, H. (1996) Mol. Cell. Biol. 16, 2898-2
90
5[Abstract].  
14.  Bergqvist, I. , Erikksson, M. , Saarikettu, J. , Erikksson, B. , Corneliu
ss
en, B. , Grundstrom, T. & Holmberg, D. (2000) Eur. J. Immunol. 30, 2857-2863[C
ro
ssRef][ISI][Medline].  
15.  Fernex, C. , Capone, M. & Ferrier, P. (1995) Mol. Cell. Biol. 15, 3217-32
26
[Abstract].  
16.  Henthorn, P. , Kiledjian, M. & Kadesch, T. (1990) Science 247, 467-470[IS
I]
[Medline].  
17.  Kiledjian, M. , Su, L. K. & Kadesch, T. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 145-15
2[
ISI][Medline].  
18.  Lenardo, M. , Pierce, J. W. & Baltimore, D. (1987) Science 236, 1573-1577
[I
SI][Medline].  
19.  Schlissel, M. , Voronova, A. & Baltimore, D. (1991) Genes Dev. 5, 1367-13
76
[Abstract].  
20.  Choi, J. K. , Shen, C. P. , Radomska, H. S. , Eckhardt, L. A. & Kadesch, 
T.
 (1996) EMBO J. 15, 5014-5021[Abstract].  
21.  Sigvardsson, M. , O'Riordan, M. & Grosschedl, R. (1997) Immunity 7, 25-36
[I
SI][Medline].  
22.  Romanow, W. J. , Langerak, A. W. , Goebel, P. , Wolvers-Tettero, I. , van
 D
ongen, J. , Feeney, A. J. & Murre, C. (2000) Mol. Cell 5, 343-353[ISI][Medline
].
  
23.  Goebel, P. , Janney, N. , Valenzuela, J. R. , Romanow, W. J. , Murre, C. 
& 
Feeney, A. J. (2001) J. Exp. Med. 194, 645-656[Abstract/Free Full Text].  
24.  Kee, B. L. & Murre, C. (1998) J. Exp. Med. 188, 699-713[Abstract/Free Ful
l 
Text].  
25.  O'Riordan, M. & Grosschedl, R. (1999) Immunity 11, 21-31[ISI][Medline].  

26.  Sigvardsson, M. (2000) Mol. Cell. Biol. 20, 3640-3654[Abstract/Free Full 
Te
xt].  
27.  Weinmann, A. S. , Bartley, S. M. , Zhang, T. , Zhang, M. Q. & Farnham, P.
 J
. (2001) Mol. Cell. Biol. 21, 6820-6832[Abstract/Free Full Text].  
28.  Cosma, M. P. , Tanaka, T. & Nasmyth, K. (1999) Cell 97, 299-311[ISI][Medl
in
e].  
29.  Fernandez, L. , Winkler, M. & Grosschedl, R. (2001) Mol. Cell. Biol. 21, 
19
6-208[Abstract/Free Full Text].  
30.  Zhuang, Y. , Barndt, R. J. , Pan, L. , Kelley, R. & Dai, M. F. (1998) Mol
. 
Cell. Biol. 18, 3340-3349[Abstract/Free Full Text].  
31.  Pan, L. , Hanrahan, J. , Li, J. , Hale, L. P. & Zhuang, Y. (2002) J. Immu
no
l. 168, 3923-3932[Abstract/Free Full Text].  
32.  Stammers, M. , Rowen, L. , Rhodes, D. , Trowsdale, J. & Beck, S. (2000) I
mm
unogenetics 51, 373-382[CrossRef][ISI][Medline].  
33.  Smith, E. M. , Gisler, R. & Sigvardsson, M. (2002) J. Immunol. 169, 261-2
70
[Abstract/Free Full Text].  
34.  Fitzsimmons, D. , Hodsdon, W. , Wheat, W. , Maira, S. M. , Wasylyk, B. & 
Ha
gman, J. (1996) Genes Dev. 10, 2198-2211[Abstract].  
35.  Malone, C. S. , Patrone, L. & Wall, R. (2000) Mol. Immunol. 37, 321-328[C
ro
ssRef][ISI][Medline].  
36.  Madisen, L. & Groudine, M. (1994) Genes Dev. 8, 




--

※ 来源:．哈工大紫丁香 http://bbs.hit.edu.cn [FROM: 202.118.247.116]