Biology 版 (精华区)

发信人: zjliu (Robusting), 信区: Biology
标  题: PCR技术简史
发信站: 哈工大紫丁香 (Mon Dec 23 16:18:27 2002) , 转信

 

                         PCR技术简史

　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于


研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性


，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。



　　PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意


义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以


致一种合适的条件---摸板DNA ，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、


复性及延伸的温度与时间。

　　PCR的改进与完善　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow


片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物


链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，


合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出


的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次


酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段


时间内没能引起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也


较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一


种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原


来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原

来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增


片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而


其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚


酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。
 



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