Biology 版 (精华区)

发信人: zjliu (Robusting), 信区: Biology
标  题: PCR技术的基本原理
发信站: 哈工大紫丁香 (Mon Dec 23 16:18:56 2002) , 转信

 



                          PCR技术的基本原理
　　

　　PCR技术的基本原理　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补


的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
　　①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩


增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
　　②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，


引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，


靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留


复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种


新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基


因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。




　　PCR的反应动力学　 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最


终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次


的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达


不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被


扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，


这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争


等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。


　　PCR扩增产物 　可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限


定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物


所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中， 以两条互补


的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸， 其5'端是固定的，3' 端则没有固定的止点，长短


不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合


成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结时， 由于新链模板的5'端序列是固定的


， 这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点， 保证了新片段的起点和止点都限定于引


物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍


数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得PCR的反应


产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
 



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※ 来源:．哈工大紫丁香 http://bbs.hit.edu.cn [FROM: 202.118.229.86]