Biology 版 (精华区)

发信人: zjliu (Robusting), 信区: Biology
标  题: PCR产物克隆方法
发信站: 哈工大紫丁香 (Mon Dec 23 16:19:30 2002) , 转信

 


                              PCR产物克隆方法

平端连接

　　通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqD


NA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱


基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。这种DNA分子的连接效率很低。由于


PCR产物的效率通过较高，。在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时，可显


著提高其连接效率。对于较短PCR产物，用PUS19的HincⅡ位点进行克隆，以X－gal和IPTG


筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合


酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。

粘端连接

　　引物中设计入限制酶位点：由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基，因此可以


在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点。这样得到的PCR产物用限制酶消化产生


粘性末端，即可与有互补粘端的载体DNA重组。这种克隆方法效率较高，且当两引物中设计


不同酶切位点时，可有效地定向克隆PCR产物。其缺点是需要加长PCR引物，除限制酶识别


序列外，还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合


。即使如此，其酶切效率也不够高。其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切。采用突变PC


R方法可克服上述缺点。该方法是通过在两PCR引物序列中改变1至数个核苷酸创造出一个限


制性内切酶位点。鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键，在PCR引物的中部


或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大。这种方法不需要增加PCR引物的长度


，而且酶切效果优于5'加端法。对于特定DNA片段的克隆，此方法较为经济、实用。但对于


基因诊断PCR产物的克隆，似乎5'加端法更为适宜。

　　T4DNA聚合回切产生粘端：如PCR两引物的5'末端是A或T，则可在其5'端分别加上CG和


CCGG。用此二引物扩增的PCR产物在dATP和dTTP存在的情况下，用T4DNA聚合酶进行处理，


则T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C，产生AccI和XmaI粘性末端（


图1）。此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接。这种方法只需在PCR引物的5


'端加2-4个碱基，但其可选择的限制酶类有限。

T－vector法

　　TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基，所加碱基几乎全是腺苷。据此，


Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物，其克隆效率比平端的连接至


少高出100倍。他们用EcoRV将pBluescript切成平端，然后在2mmol/LdTTP存在下，用TaqD


NA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷。因

　　为在4种dNTP都存在时，Taq聚合酶选择性参入dATP，而当仅一种dNTP存在时，它只能


参入该种碱基。因此，在只加入ddTTP时，用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端


突出一个胸苷的T尾载体，称为T－vector。用这种T－vectorsk可以较有效地直接克隆PCR


产物。Hotton等人也报道了另一种制备T－vector的方法。他们使用脱氧核苷酸末端转移酶


在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个胸苷。由于末端转移酶可以催化多个碱基（ddTTP


）作为底物，使平端载体DNA分子的两个3'末端各加上一个T。用这种方法制备的T－vecto


r的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接，仅5'末端可与PCR产物的


3'末端形成磷酸二脂键。

共环消解法

　　最近，Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方法。用磷酸化的PCR引物扩增得到的


PCR产物，先用T4DNA连接酶催化连接反应，使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成


共环结构。然后再用相应的限制酶进行消化，产生粘端DNA片段。对于对称性限制酶位点，


只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列，因为在串接成共环后能恢复限制酶切位点难于切


开的缺点，且可用于双限制酶切位点的设计，只不过有PCR产物共环化后，仅约1/4的限制


酶切点得以恢复。故此法较适用于单限制酶位点的克隆。

　　无连接酶亚克隆法(A)无连接酶克隆法（ligase-free subcloning，LFS）是利用引物


5'末端附加碱基修饰法，修饰碱基不是酶切位点，而是与某一质粒两端分别互补的碱基。


两引物的3'端约20-25个核苷酸分别与待扩增DNA两翼互补，5'端各有约24个核苷酸分别与


线性化质粒的3'端相同的附加序列。由于线性化质粒的3'端序列各不相同，PCR片段可以通


过选择各引物的合适5'附加序列与引物3'端定向杂交。

　　由此物a和b产生的两端有附加序列的PCR产物与未反应引物分离后，分别加入两只含有


线性化质粒的反应管中进行第二次PCR。第1管中用引物a和c，引物a即为第一PCR扩增的上


游引物a，引物c为下游引物，与紧邻5'端附加序列内测的质粒（+）链互补。同样，第2管


的引物为b和d，引物b与第一次PCR扩增的下游引物b相同，引物d为上游引物，与紧邻5'附


加序列内侧的质粒（-）链互补。

　　第二次PCR的第一循环中，PCR产物与质粒均变性与复性。除自身复性产物（这种复性


产物不被扩增）外，PCR产物与质粒可通过各自3'端互补序列杂交成部分异源双链，延伸时


，重叠的3'端互为此物沿各自互补链延伸，结果可产生PCR片段与线性质粒的"连接"。然后


两管中PCR扩增各进行15-20个循环。这便可产生大量一端管1）或另一端连接有PCR插入片


段的质粒。 第二次PCR后将第1管与第2管反应液混合，用碱变性双链，中和后稀释变性的


DNA。反应管中的单链DNA可以复性或几种不同的产物，除各自本身复性产物外，管1产物s


sDNA与管2中ssDNA可形成部分异源双链DNA，并各自有一较长的5'或3'悬端，这种长的5'或


3'悬端相互互补，在低DNA浓度时可复性产生环化DNA。

　　尽管这种环化的DNA有两个缺口，但它们可以直接用来转化受体大肠直杆菌。一旦进入


体内，两个缺口便共价连接，修复的质粒即可复制，下面以从λ噬菌体DNA中扩增-500bp片


段，并克隆入pGem4Z载体中为例说明LFS法。

　　这种方法同样适于复杂基因组中基因片段的克隆。需注意的是第一次PCR时两引物的5


'附加序列不应太短以免影响第二次PCR时异源双链的形成，以24个核苷酸较为合适。扩增


时若形成，引物二聚体，一定要去除，否则会严重影响转化率。用LFS法已成功地克隆了长


达1.7kb的基因片段。这种方法的优点是：①可用于常规方法无法进行亚克隆的片段；②适


于任何PCR产物和任何质粒；③可亚克隆特殊目的（如含点突变、缺失或插入等）片段；④


在某些情况下，对已构建了启动子或增强子等序列的载体，可使待表达片段插入定向合适


位置；⑤较快，可在1d内完成，较常规方法可靠，不需DNA连接酶。

　　DNA克隆是分子生物学的重要内容。特定基因的克隆常因两端缺乏合适限制酶切点而受


因，cDNA的克隆通常也效率不高、筛选因难。采用PCR技术行DNA和cDNA的克隆，则可大大


缩短克隆时间，比之全基因合成更为经济和方便，因而愈来愈受重视。用PCR方法进行传染


性疾病和遗传性疾病的诊断常遇到产物的异性问题和分型问题，采用产物克隆和测序方法


，比之寡核苷酸探针杂交方法更为准确。随着PCR技术的不断发展和推广，新的PCR产物的


克隆方法也将不断出现。
 



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