Biology 版 (精华区)

发信人: zjliu (Robusting), 信区: Biology
标  题: PCR反应体系与反应条件
发信站: 哈工大紫丁香 (Mon Dec 23 16:19:59 2002) , 转信

 



                        PCR反应体系与反应条件

标准的PCR反应体系：

　　　　　　 10×扩增缓冲液 　 10ul
　　　　　　 4种dNTP混合物 　 各200umol/L
　　　　　　 引物 　　　　 　 各10～100pmol　
　　　　　　 模板DNA 　　　 　0.1～2ug　
　 　　　　　Taq DNA聚合酶 　 2.5u　
　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L
　　　　　　 加双或三蒸水至 　100ul

　　PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

　　引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的


程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物


，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。


ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引


物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基


不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶


切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物


的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会


引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。


　　酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然


酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体


积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。


　　dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，


如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaO


H或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融


会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等


( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓


度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。


　　模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统


的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上


的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋


白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂


酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为


模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消


化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸


胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。


　　Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种


dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降


低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。


　　PCR反应条件的选择
　　PCR反应条件为温度、时间和循环次数。

　　温度与时间的设置： 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准


反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并


结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模


板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火


与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有


较高的催化活性)。
　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况


下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因


为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致P


CR失败。
　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速


冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模


板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的


长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物


，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合


适的温度：
　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，


 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。


　　③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
　　PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利


于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内


的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15m


in。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长


些。


　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一


般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
 




--

※ 来源:．哈工大紫丁香 http://bbs.hit.edu.cn [FROM: 202.118.229.86]