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发信人: cameran (竹晨), 信区: Biology
标  题: DNA聚合酶(DNA Polymerase)
发信站: 哈工大紫丁香 (2001年07月04日12:46:09 星期三), 站内信件


DNA聚合酶(DNA Polymerase)
　　此酶最早在大肠杆菌中发现，以后陆续在其他原核生物及微生物中找到。这类酶的
共同性质是:[1]以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA;[2]需要模板和引物的存
在;[3]不能起始合成新的DNA链;[4]催化dNTP加到生长中的DNA链的3'-OH末端;[5]催化D
NA合成的方向是5'→3'。下面首先介绍大肠杆菌的DNA聚合酶，然后简略说明一下其他原
核生物的DNA聚合酶和真核生物DNA聚合酶。
　　1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ，DNApolⅠ)这是1956年由ArthurKornb
erg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornber酶。此酶研究得清楚而且代表了其他DNA聚合酶
的基本特点。
　　(1)理化性质：纯化的DNApolⅠ由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，MW为1
09KD。分子含有一个二硫键和一个-SH基。通过二个酶分子上的-SH基与Hg2+结合产生二
聚体，仍有活性。每个酶分子中含有一个Zn2+，在DNA聚合反应起着很重要的作用。每个
大肠杆菌细胞中含有约400个分子，每个分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸掺入正
在生长的DNA链。经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成两个片段，大片段分子量为
76KD，通常称为Klenow片段，小片段的分子量为34KD。此酶的模板专一性和底物专一性
均较差，它可以用人工合成的RNA作为模板，也可以用核苷酸为底物。在无模板和引物时
还可以从头合成同聚物或异聚物。
　　DNAPolⅠ在空间结构上近似球体，直径约65A。在酶的纵轴上有一个约20A的深沟(c
left)，带有正电荷，这是该酶的活性中心位置，在此位置上至少有6个结合位点:[1]模
板DNA结合位点;[2]DNA生长链或引物结合位点;[3]引物末端结合位点，用以专一引物或
DNA生长链的3'-OH;[4]脱氧核苷三磷酸结合位点;[5]5'→3'外切酶活性位点，用以结合
生长链前方的5'-端脱氧核苷酸并切除之;[6]3'→5'外切酶活性位点，用以结合和切除生
长链上未配对的3'-端核苷酸。
　　(2)功能：
　　[1]聚合作用:在引物RNA'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ
逐个将核苷酸加上去，就是DNApolⅠ的聚合作用。酶的专一性主要表现为新进入的脱氧
核苷酸必须与模板DNA配对时才有催化作用。dNTP进入结合位点后，可能使酶的构象发生
变化，促进3'-OH与5'-PO4结合生成磷酸二酯键。若是错误的核苷酸进入结合位点，则不
能与模板配对，无法改变酶的构象而被3'-5'外切酶活性位点所识别并切除之。
　　[2]3'→5'外切酶活性──校对作用:这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和
切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚
合作用而出现暂时的游离现象，从而被3'→5'外切酶活性所降解。如果提高反应体系的
温度可以促进这种作用，这表明温度升高使DNA生长链3'末端与模板发生分离的机会更多
，因而降解作用加强。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才
会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3'→5'外切酶活性的
主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3'→5'外切酶切除，
以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。在某些T4噬菌体突变株中DNA复制的真实性降
低，而易发生突变，从此突变株分离得到的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性很低。相反
，另外一些具有抗突变能力的T4突变株中的T4DNA聚合酶的3'→5'外切酶活性比野生型高
得多，因此，其DNA复制真实性好，变异率低。可见，3'→5'外切酶活性对DNA复制真实
性的维持是十分重要的。
　　[3]5'→3'外切酶活性──切除修复作用:5'→3'外切酶活性就是从5'→3'方向水解
DNA生长链前方的DNA链，主要产生5'-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部份(双链
)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5'→3'。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合
作用能刺激5'→3'外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起
着重要作用。对冈崎片段5'末端DNA引物的去除依赖此种外切酶活性。
DNA聚合酶Ⅰ3'→5'和5'→3'外切酶活性比较
特性 3'→5' 5'→3'
底物末端 非常特异:只识
别D-核糖的
3'-OH 特异性不高:DNA或RNA中配
对的或错配的碱基均可，5'端带有
-OH或带有一磷酸、二磷
酸、三磷酸
二级结构 单链或双链
DNA中不配对
的末端 双链DNA的配对碱基末端
产物 只有5'-单核苷酸 5'-单核苷酸占80%，寡核苷
酸20%
内切酶作用 无 可切割从末端起8-100个核苷
酸处的二酯键
聚合作用对其
活性的影响 完全抑制 可提高活性10倍，而且寡核
苷酸产物增多
作用 复制校正 缺口平移，切去DNA末端的
RNA引物
　　[4]焦磷酸解作用:DNApolⅠ的这种活性可以催化3'末端焦磷酸解DNA分子。这种作用
就是无机焦磷酸分解DNA生长链，可以认为是DNA聚合作用的逆反应，而且这种水解DNA链
作用需要有模板DNA的存在。(dNMP)n+XPPi←(dNMP)n-x+X(dNPPP)→DNA
　　[5]焦磷酸交换作用:催化dNTP末端的PPi同无机焦磷酸的交换反应。反应式为32P32
Pi+dNPPP←dNP32P32P+PPi→DNA
　　最后两种作用，都要求有较高浓度的PPi，因此，在体内由于没有足够高的PPi而无
重要意义。
　　DNApolⅠ的DNA聚合酶活性和5'→3'外切酶活性协同作用，可以使DNA链上的切口向
前推进，即没有新的DNA合成，只有核苷酸的交换。这种反应叫缺口平移(Nick transla
tion)。当双链DNA上某个磷酸二酯键断裂产生切口时，DNApoIⅠ能从切口开始合成新的
NDA链，同时切除原来的旧链。这样，从切口开始合成了一条与被取代的旧链完全相同的
新链。如果新掺入的脱氧核苷酸三磷酸为α-32P-dNTP，则重新合成的新链即为带有同位
素标记的DNA分子，可以用作探针进行分子杂交实验。
　　尽管DNApolⅠ是第一个被鉴定的DNA聚合酶，但它不是在肠杆菌中DNA复制的主要聚
合酶。主要证据如下:[1]纯化的DNApolⅠ催化dNTP掺入的速率为667碱基/分，而体内DN
A合成速率要比此高二倍数量级;[2]大肠杆菌的一个突变株中，此酶的活力正常，但染色
体DNA复制不正常;[3]而在另一些突变株中，DNApolⅠ的活力中只是野生型的1%，但是D
NA复制却正常，而且此突变株增加了对紫外线、烷化剂等突变因素的敏感性。这表明该
酶与DNA复制关系不大，而在DNA修复中起着重要的作用。
　　2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ(DNApolⅡ)：DNA聚合酶Ⅰ缺陷的突变株仍能生存，这表明
DNApolⅠ不是DNA复制的主要聚合酶。人们开始寻找另外的DNA聚合酶，并于1970年发现
了DNApolⅡ。此酶MW为120KD，每个细胞内约有100个酶分子，但活性只有DNApolⅠ的5%
。该酶的催化特性如下：
　　(1)聚合作用:该酶催化DNA的聚合，但是对模板有特殊的要求。该酶的最适模板是双
链DNA而中间有空隙(gap)的单链DNA部份，而且该单链空隙部份不长于100个核苷酸。对
于较长的单链DNA模板区该酶的聚合活性很低。但是用单链结合蛋白(SSBP)可以提高其聚
合速率，可达原来的50-100倍。
　　(2)该酶也具有3'→5'外切酶活性，但无5'→3'外切酶活性。
　　(3)该酶对作用底物的选择性较强，一般只能将2-脱氧核苷酸掺入到DNA链中。
　　(4)该酶不是复制的主要聚合酶，因为此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常
。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。
　　3．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ(DNApolⅢ)：DNA pol Ⅲ全酶由多种亚基组成(见下表)，
而且容易分解。大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子，因此不易获得纯品，为研究该
酶的各种性质和功能带来了许多困难。直到不久前，才对其性质和功能有所了解，但每
个亚基的具体作用扔不十分清楚。尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催化脱氧核苷
酸掺入DNA链的速率分别是DNA聚合酶Ⅱ的15倍和30倍。该酶对模板的要求与DNA聚合酶Ⅱ
相同，最适模板也是链DNA中间有空隙的单链DNA，单链结合蛋白可以提高该酶催化单链
DNA模板的DNA聚合作用。DNApolⅢ也有3'→5'和5'→3'外切酶活性，但是3'→5'外切酶
活性的最适底物是单链是DNA，只产生5'-单核苷酸，不会产生二核苷酸，即每次只能从
3'端开始切除一个核苷酸。5'→3'外切酶活性也要求有单链DNA为起始作用底物，但一旦
开始后，便可作用于双链区。DNA聚合酶Ⅲ是细胞内DNA复制所必需的酶，缺乏该酶的温
度突变株在限制温度(non permissive temperature)内是不能生长的，此种突变株的裂
解液也不能合DNA，但加入DNA聚合酶Ⅲ则可以恢复其合成DNA的能力。
DNA聚合酶Ⅲ的组成
亚基 分子量(×103) 其它名称
a 140 dnaE蛋白，polC蛋白
ε 25 　
θ 10 　
τ 83 　
γ 52 dnaZ蛋白
δ 32 dnaX蛋白
β 40 dnaN蛋白，copolⅢ
大肠杆菌三种DNA聚合酶的特性
功能 polⅠ polⅡ polⅢ
聚合作用5'→3' + 　 +
外切酶活性3'→5' + + +
外切酶活性5'→3' + + +
焦磷酸解和焦磷酸交换作用 + - +
模板及引物的选择 　 　 　
完整的DNA双链 - - -
带引物的长单链DNA + - -
带缺口的双链DNA + - -
双链而有间障的DNA + + +
一般性质 　 　 　
分子量 109KD 120KD ＞140KD
每细胞中的分子量 400 17-100 10-20
结构基因 polA polB polC
　
　　4.T4-DNA聚合酶(T4-DNApol)：近年来在枯草杆菌，鼠伤寒沙门氏杆菌等细胞及噬菌
体T4、T5、T7中分离到NDA聚合酶，这里只介绍T4DNA聚合酶。T4DNA聚合酶与大肠杆菌D
NA聚合酶Ⅰ相似，也是一条多肽链，分子量亦相近，但氨基酸组成不同，它至少含有15
个半胱氨酸残基。但是，它在作用上与大肠杆菌DNApol不同;[1]它无5'→3'外切酶活性
;[2]它需要一条有引物的单链DNA作模板。在有缺口的双链DNA作模板时，需要有基因32
蛋白的辅助(基因32蛋白在T4DNA复制中的作用和大肠杆菌单链结合蛋白的作用相似，基
因32蛋白在复制叉处和单链DNA结合后可以促进双链的进一步打开，并保持其单链状态有
利于新生链的合成);它利用单链DNA为模板进，可同时利用它作为引物，即此单链DNA的
3'端能环绕其本身的某一顺序形成氢键配对，3'端的未杂交部分即被T4DNA聚合酶的3'→
5'外切酶活性切去，然后在其作用下从3'-OH端开始聚合，合成该模板DNA的互补链，再
以互补链为模板合成原来的单链DNA。
　　5真核生物的DNA聚合酶：真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚合酶都没有3
'→5'或5'→3'外切酶活性。其聚合反应机制与原核生物的聚合一样。主要的酶(占总量
的80-90%)是DNA聚合酶α，分子量为300KD，含有4个或5个亚基，主要负责染色体DNA的
复制。DNA聚合酶β，分子量为45KD，仅含有一条链，主要作用是修复核内DNA。第三种
聚合酶γ，分子量为140KD，存在于线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。最近从兔的
骨髓细胞质中分离到一种新的DNA聚合酶，这种酶与上述真核生物的DNA聚合酶不同，而
与原核生物的聚合酶类似，具有3'→5'核酸外切酶活性，称为DNA聚合酶δ。另外，从酵
母、原虫等低真核生物中分离到一些DNA聚合酶。一般来说，这些低等生物都没有低分子
量的DNA聚合酶β，而且与原核生物的DNA聚合酶相似，有3'→5'外切酶活性。

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欲讯秋情众莫知, 喃喃负手叩东篱。
孤标傲世偕谁隐，一样花开为底迟？
圃露庭霜何寂寞，鸿归蛩病可相思？
休言举世无谈者，解语何妨片语时。

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