Biology 版 (精华区)

发信人: lilyhua (1000), 信区: Biology
标  题: 第二课基因治疗的实验方法
发信站: 哈工大紫丁香 (2003年05月14日21:22:02 星期三), 站内信件

基因治疗的实验方法
　　虽然对作为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床方案的进展
仍然缓慢。问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。本章将评估这一新医疗领域的
问题和潜在的答案。
　　人类基因治疗的第一个认可的临床试验报告始于1990年9月。自此以后的七年半时间
里，世界上，已认可了300份临床试验报告，超过3000个病人体内已进行了遗传工程化细
胞的治疗。从这些试验中得出的结论是：基因治疗对治疗人类多种疾病有潜在的优势，
并产生很低的副作用，然而在解决病人疾病方面，其效率仍失望地低。除了不是根据对
照临床试验报告的个别病人得到帮助外，仍没有论据证明基因治疗试验在人类疾病的治
疗上已经成功。为什么这样说？
　　本章将通过评估原先设想及基因治疗的问题来考察“为什么这样说？”根据把基因
输送到受影响组织模式的不同，有体细胞基因治疗的不同方式（见Box 1）。其挑战是把
基因治疗作为一种有效和安全的药物输送系统去开发。该目标比五年前许多研究人员曾
期待获得的更困难。人体花费了几千年时间学到了如何保护自己免遭外来环境的侵犯，
包括把外来DNA结合到自身的基因组中去。然而，病毒在克服这些障屏并能把自身的遗传
物质嵌入人体细胞方面只获得了部分成功。因此，在基因治疗方面的初始努力已直接朝
着工程病毒方向前进，这种病毒可作为载体去携带治疗基因进入病人。近期曾发表大量
有关基因治疗方面的文章。这些文章将依次确认了各种病毒的分类。
　　Box1：体细胞基因治疗的三种类别
　　第一种是离体（ex vivo）,这种方法是将细胞从人体中移出，用载体孵化后形成的
基因工程细胞再回至人体中，这种步骤常用于血细胞，因为它们最容易被移进移出。
　　第二种方法是在位点（in situ）上，这种方法是直接将载体放入需治疗的组织中去
。例子是把腺病毒载体浸入带囊纤维病人的气管和支气管中，用携带细胞素或毒素基因
的载体注入肿瘤，或将携带有肌细胞增强蛋白的基因直接注入具肌肉营养障碍病人的肌
肉中。
　　第三种方法是在活体（vivo）上，这种方法的载体能被直接注入血液中，这第三种
方法还未有临床例子，但如果基因治疗作为一种治疗选择来完成它的承诺的话，必须开
发体内可注入载体。
　　以RNA病毒为基础的载体
　　逆转录病毒一开始就作为最有希望的基因转化载体来选择的，目前利用逆转录病毒
的临床试验占了所有被认可报告的60%。因为RNA病毒能执行将有效基因转化至许多类型
细胞中去的任务并能稳定地把它们集合到寄主细胞的基因组中（图1），因而也就提供了
长期表达的可能性。因为逆转录病毒已被结合进有关的非致病源寄生物中，所以它有最
小的危害性（虽然有例外，例如人类免疫缺陷病毒“HIV”和人类T细胞亲淋巴病毒“HT
LV”），尤其是鼠白血病病毒（MULV）已被传统地用于临床基因治疗试验选择，曾开发
了把载体基因组封入病毒颗粒的各种包装系统。已被移去所有病毒基因的载体本身是充
分复制缺陷并接受达到大约8Kb（Kilobase）外源性DNA。
　　研究人员若要开发高效治疗疾病的逆转录病毒载体，将面临四个关键问题：获得高
效输送、传导非分离细胞、维持长期的基因表达和开发制造载体的经济方法。
　　获得高效输送。采用逆转录病毒的临床试验报告主要使用体外方法。目前，采用逆
转录载体传导的细胞，它们具有高水平的天然MuLV(amphotropic)受体并在暴露载体的时
间里进行分离。虽然有少量细胞类型不能被分离，但能在体内生长的大多数细胞能被传
导。一种重要的靶细胞是初级的钩状促白细胞生长素干细胞（HSC），因为基因传导进入
这类细胞将为受体生命产生基因工程细胞。然而，HSCs有一种低水平的酸-碱兼性受体，
它具弱传导性。因此，HSCs仍是重要的目标但难以捉摸。
　　具有兼性受体的广泛范围的细胞类型据知是磷酸盐同向运转，这种磷酸盐限制了这
些受体在体内方法中特殊目标的运用。使用不同的病毒包封认识不同受体的蛋白质，（
例如，囊状口炎病毒（VSV）-G蛋白或gibbon类人猿白血病病毒（GALV）包封蛋白）,能
改变受到传导的细胞范围，但仍不能提供更多特异性。其困难在于，因为逆转录病毒不
能在高滴定度上产生，（兼性受体将被限制于每毫升形成1×107菌落单位和假型VSV-G受
体至每毫升1×109CFU），这不可能为in vivo期望的细胞类型得到大量的受体颗粒。病
毒颗粒将被束缚于它们遭遇到的许多细胞中，这样，在它们到达它们的目标之前就已被
稀释出去。（其它的组织，例如中间补体消失将在后面讨论）。问题能定量化，人体包
含大约5×1013细胞，如果一个病人得到100毫升逆转录病毒样品，那大约是1×109活性
载体颗粒。即使每一受体颗粒对感染是100%特异性，只要有1/50000细胞被传导。需要的
东西是优先束缚于它的目标的逆转录病毒颗粒并能在高滴定度上制造出来。
　　对特殊靶细胞类型的探索已集中于企图建造天然逆转录病毒包封蛋白上。包封蛋白
有两种功能：束缚于它的受体，（通过表面（SU）部分）能进入病毒核蛋白核心中（主
要由转导膜（TM）部分执行）。SU蛋白束缚于靶细胞表面的受体上，因此，经SU/TM络合
，使病毒和细胞膜产生结构变化，接着病毒核（带有病毒的遗传信息）进入靶细胞的细
胞质中。（图1）。
　　提供靶细胞特殊性的两种主要方法继续进行。首先，SU蛋白的天然束缚受体区域曾
被配体或认识特殊细胞表面受体的单链抗体所代替，曾靶向范围广泛的收体。但是困难
在于，即使在工程化载体和靶细胞受体之间能获得特殊束缚，在实验中的基因转化仍很
低。理由是清楚的，想象逆转录病毒包封蛋白将变成了具有络合四元结构的三聚体。当
天然束缚区域被外来序列取代时，整个包封蛋白的结构发生变化，结果产生新的蛋白构
象，这种改变导致了不能发生病毒和细胞膜之间的融合，没有融合就不能发生有效的核
进入和基因转化。
　　在创建US的束缚受体区域的同时，为执行核进入而保持包封蛋白的能力将需要更好
地掌握包封络合蛋白中的结构—功能关系。这种认识随着最近发表的有关鼠亲病毒SU蛋
白束缚受体区域的三维结构而获得进展。工程化配体嵌进具有为核进入而保持包封蛋白
功能性高机率的SU蛋白中的各个特殊位置，目前成为可能。
　　逆转录病毒包封蛋白的另一个结构—功能研究也有助于我们理解在束缚后如何获得
高效的核进入。去年发表了Moloney亲病毒逆转录病毒TM蛋白的部分三维结构。最近在预
见包封蛋白的三聚结构中，已显示出它的分离单体能彼此交联。换句话说，每个有缺陷
的分离单体，彼此能互补以便提供一种活性三聚体包封。运用这种工艺有可能去定义TM
蛋白中的分离功能区域。当使完成包封蛋白三维结构和功能区域变成可知时，具有高效
靶特性细胞的结构逆转病毒载体有可能产生。
运用第二种主要的称之为“链”（tethering）靶方法曾获得进展。虽然曾设计了几种创
造性系统，但目前最成功的方法是将认识细胞外基质（ECM）成份的配体嵌进不能扰乱天
然束缚受体区域的部分SU蛋白中。链（tethering）浓缩靶细胞附近ECM中的载体。然后
束缚受体和核进入通过天然包封—受体机理产生。出现特别用于基质的两种配体是特性
溶胶、纤维结合素。纤维结合素是存在于正常的ECM中，暴露的溶胶存在于危险区域，例
如，血管成形术后心血管系统伤口损伤处。
　　非分离细胞的传导。 虽然基于MULV的逆转录病毒载体不能去传导非分离细胞这点在
某些状态非常有用，例如，当毒素基因被嵌进分离癌细胞并不会进入正常的非分离细胞
（见下面的“临床试验”），在许多状态中，有一种要求即把一种治疗基因嵌进正常的
非分离细胞中。许多潜在的靶细胞不会激活分离活体；只有某些血细胞（而不是干细胞
）和细胞衬里胃肠束继续分离。慢病毒（例HIV—1）能够感染非分离细胞，因为再结合
能产生致病原病毒的可能性而使这些病毒来的载体结构超过安全范围。企图转化至鼠逆
转录病毒，结果从允许传导非分离细胞HIV来的特殊信号没有获得成功。最近，有可能在
逆转录病毒中使用刚好22%的HIV基因组（不包含任何引起病源体的基因）。由于使用了
非—HIV外膜蛋白而进一步减少了再结合的机会。杂交系统（hybrid system）以同样的
方式为提供体内传导非分离细胞的选择负有重大责任。另一种正在开发的RNA病毒是根据
人类泡沫病毒来开发的。这些载体能传导广泛范围的细胞类型，不能被人类血清激活，
并有可能传导某些非分离及分离细胞。
改进基因表达。假设开发高效的基因能传导的话，那末接下来的目标便是使基因表达长
效稳定在一个合适水平上，这正是当前载体最大的不足。虽然我们仅是在逆转病毒载体
中讨论基因表达问题，但它可应用到所有类型的基因传导载体中。
　　基因转化后要保持稳定的表达，与几种因素有关。首先，控制基因表达的调节顺序
不能经常保持活化状态。存在一种细胞认识外来催化剂的的趋势，（尤其如类人猿病毒
40（SV40）和巨细胞病毒（CMV）），并不能激活它们（通过甲基化或其它机理）。到目
前为止，仍很少掌握淋巴激活素、细胞素和其它生长因素在基因表达中的作用。其次，
即使基因在细胞中保持活性但细胞经常死亡。为识别、消除外源基因产物及产生外源蛋
白细胞而设计免疫系统，从逆转录病毒载体中消除所有病毒基因。所以，病毒蛋白的免
疫识别（有一种情况例外，如病毒壳体蛋白被包埋在病毒颗粒中）不是目的（但见下面
腺体载体的讨论）。尽管如此，免疫系统仍可能识别由治疗基因产生的新的或修正过的
蛋白；一种新合成的正常蛋白将对从未为它暴露过的免疫系统作出反常表现。
　　细胞自身顺-调节DNA序列的使用将可能比用病毒催化剂获得更稳定长效基因表达，
但要确认基因调节系统的所有成分可能是困难的。作为一种极端的情况，与血红蛋白（
B-珠蛋白）基因部分调节有关的调节序列扩散超过近100kb。因为逆转录病毒仅能提供6
—8Kb序列，所以被结合到这种载体前可能需要截断调节序列至它们的最小基本长度。甚
至当使用天然调节分子时，因缺乏微弱信号和适宜细胞环境的正常操作反馈机理而不能
校正功能。例如，当胰岛素增强剂/催化剂输送至成纤维细胞中去时仍不能调节表达。再
有，要强调的是：需要开发具有基因转化成特殊细胞型能力的载体。
　　根据各方面的稳步进展，长久、稳定和适宜的体内基因，将在广泛范围细胞型中完
成表达。一旦清除了这些障碍，那么下一步的目标将是获得能调节的基因表达。许多重
要的靶基因，例如，胰岛素不能在所有时间表达在同样水平上，而且应答体内的生理信
号。目标是使用应答体内自身的生理信号（为此嵌入的治疗基因起到内源基因运行的作
用）或者输送能控制基因活性水平的药物。在某些情况下，仅保持基本不起调节表达的
低水平可能是有利的，（例如，血友病或腺苷脱氨基酶（ADA）缺陷），而在另一种情况
下，可能需要牢固的调节（例如。糖尿病中的胰岛素生产）。
　　制造载体。虽然10年前，医药公司还不能生产上百万基因治疗载体药片，现在却能
够了。逆转录病毒载体是生物剂：它们只能从活体细胞中制得。生物学系统在执行由食
品和药物行政管理机构制定的产品制造工艺（GMP）、质量安全/质量控制步骤上（GA/G
C），不是件最容易的事，疫苗生产已经学到了。
　　与逆转录病毒载体相关的主要问题之一，是有可能在制造过程中增加复制活性逆转
录病毒。因为，逆转录病毒载体是在包裹缺陷病毒基因组的包裹细胞中生产出来的，因
为逆转录病毒载体有高的再结合倾向，所以上述的可能性出现了。进一步说，当每一个
哺乳动物包含内源逆转录病毒时，附加的病毒序列可能被结合进RCR，或许就产生了致病
源病毒。
　　另一个潜在的问题起因于逆转录病毒载体随机结合进入寄主细胞DNA中的能力。例如
载体可能自身嵌进肿瘤超表达基因中去，这样就增加了细胞演变成癌细胞的倾向。1992
年发表了在大型动物逆转录病毒基因转化实验中，出现唯一并不要求产生肿瘤的例子。
在10只猕猴的骨髓受到辐射破坏时，报道了淋巴瘤的三种情况，然后用曾对大量RCR（而
不是逆转录病毒载体）和实验载体暴露过的造血干细胞，做骨髓移植，结果表明产生了
RCR集聚的癌，是交流活动且仅是在逆转录病毒6---7个月后发展起来的。
　　RCR生产及其潜在的肿瘤生产课题在对NIH重组体 DNA顾问委员会（RAC和FDA）的报
告中被广泛地作了分析。结论是目前根据FDA要求采用的QA/QC步骤极不可能使得任何病
人接受充分的RCR以便既产生逆转病毒血液又产生恶性肿瘤。然而，制造和试验过程确信
安全的程度是复杂而昂贵的。
　　当目前研究的目标是把生产的基因治疗载体直接注射进人体时，（恰如青霉素和胰
岛素），必须考虑到其它问题。例如，鼠包裹细胞产生逆转录病毒载体，它遭到人体活
性的破坏。虽然敏感性使得载体颗粒“安全”，它显著地减少他们体内的半蓑期和基因
传导的效率。产生敏感的主要成分起因于在病毒糖蛋白上唯一存在的糖基，而病毒糖蛋
白产生于使病毒颗粒对人体活性系统敏感的鼠包裹细胞上。或者让鼠细胞上产生的载体
颗粒工程化以避免人体活性系统，或者载体需产自非鼠包裹细胞线，在这条生产线上生
产出的载体表面能提供合适糖基的病毒颗粒。然而，正如以上所述，基本上所有的哺乳
动物细胞有他们自己的内源逆转录病毒，而这些内源逆转录病毒载体能与载体再结合，
结果产生新的潜在致病源RCR；许多内源病毒仍然是未知的。虽然任何细胞线是值得怀疑
的，但灵长类或人类细胞作为包裹细胞在涉及的相关点上达到了最大的安全性。然而，
人类包裹细胞只有工程化才非常安全，例如，在从env基因中分离出DNA的结构上，产生
病毒gag—pol基因及其它安全特点的ProPak细胞线，一定要比鼠包裹线PA317更安全，它
是目前用得最多的逆转录病毒载体临床试验。
　　这些课题是可解决的，但为面向世界市场生产安全、高效基因治疗载体而开发低成
本制造系统，将花费几年的产品发展。虽然避免许多问题的非病毒输送系统可能是将来
的基因治疗载体（见下面的“非病毒载体”），许多目前和将来运用逆转录病毒载体的
临床试验，需要解决安全和高效的制造课题。
　　根据DNA病毒的载体
　　腺嘌呤病毒载体。最广泛用于基因错位载体的DNA病毒是腺嘌呤病毒（特别是血清型
2和5）。腺嘌呤病毒载体有几个正属性：它们是大，因而能具备大DNA嵌入，（直至35k
b,见下面）；它们是人体病毒并能在高水平上传导大量不同人类的细胞类型（经常在体
内达到100%）：它们能传导非分离细胞：它们在培养剂中能产生高的滴定度。它们曾为
几个实验室作囊纤维的肺倂发症治疗试验提供选择细胞的载体，以及用于治疗癌症的各
种试验。
　　腺嘌呤病毒载体也有几个缺点，第一代载体为早期的区域1功能所删去以便提供它们
复制缺陷。其次，载体在E3区域被删去，以便为变转基因嵌入创造空间。E3在下面讨论
，它在病毒感染期起到抑制寄主免疫应答的作用，但不需要在体内复制或包裹。删去E1
和E3的载体诱发强的炎症和免疫应答。这一想法有待腺嘌呤病毒蛋白在传导细胞中的“
渗漏”表达结果，因为第一代的载体保留了大多数的病毒基因组。如果其它的病毒基因
被删除的话，它希望产生微弱的免疫应答。E1删除基因与删除的其他基本早期基因的偶
合载体E2a和/或E4，或者删除所有病毒基因的载体已被结构化并用于动物试验。存在关
于体内免疫遗传弱小载体免疫遗传、基因表达的稳定性持久性的矛盾报告。事实上这些
不同性质取决于精确的载体设计、被引进载体的组织类型以及传导基因嵌入的性质。尤
其是弱小载体提供引进35Kb基因组序列的可能性，因此提出包括核基质进攻区域可促进
长期基因表达和载体序列的持久性建议。
　　删除越来越多的病毒基因并不总是先进的方法，因为某些基因可作出有益的贡献，
例如，抑制了对抗载体的免疫应答，它们的被删除可能增加了载体被消除的速度，举个
例子，E3区域编码保护病毒的相对分子量为19K蛋白，可从寄主免疫监督中设计细胞。各
种有效的机理被包括在病毒载体的清除中，同側显示序列可帮助保持腺嘌呤基因组在细
胞中的稳定性。作为药物试验，动物总不能反应病人发生的东西，在灵长类中产生炎症
应答的载体可能不会在人类病人中发生，而相反的情况则可能发生。最近，第一个“真
正”一期基因治疗临床试验已经开始：为了确定对人体腺嘌呤载体的免疫应答，对照志
愿者已经进行腺嘌呤载体皮下注射试验（现在采用支气管注入），目的是测定人体对腺
嘌呤载体的免疫应答。
　　通过设计病毒基因的正确结合（可能掺合各种来源的免疫抑制基因，同时消除刺激
免疫基因产物和减少病毒壳体蛋白免疫遗传），不能被培育的腺嘌呤载体可能有低的毒
性度，不产生免疫应答，因此会重复出现。这后一种观点是是重要的，因为腺嘌呤载体
不会集成并在细胞中幸存有限的时间（虽然在非分离细胞中可能延长间隔时间）。
　　管理载体重复性的能力在许多治疗报告中将是严格的，例如，在血友病及囊纤维中
便是如此。虽然设计不能激发免疫应答的载体将是昂贵的选择，但间歇应答能用于病人
的瞬时免疫限制，以便允许载体的重复管理。另一方法是需要为抗原的免疫应答作阻止
共刺激的相互作用，进行载体管理期的瞬时“束缚”免疫系统并使重复管理成为可能。

与腺嘌呤相关的病毒载体。运用于临床试验的另一个DNA病毒是与腺嘌呤相关的病毒AAV
。（这是一种非致病源病毒，它广泛分布于人类人群中（大约人类的80%有直接抗AAV的
抗体）开始对这种病毒产生兴趣是因为只知道哺乳动物病毒优先集成进入基因组的特殊
区域（进入人类短臂染色体）。当该病毒不产生疾病时，它的嵌入位置出现在基因组的
安全区域。因此可用于设计支配把特殊位置嵌进基因治疗载体。不幸的是，虽然曾建议
设计保留某些特殊性的载体，但目前的载体出现了整合进入非特殊区域的现象。
　　即使还不曾获得整合位置特殊性，AAV曾显示出传导脑、骨骼肌肉、肝和合理的CD3
4+血细胞效应。然而，存在几种缺点：某些细胞需要非常高的复杂感染（为获得传导需
要的每个细胞病毒颗粒数量）；AAV是小的，仅允许添加4.8kb大小的DNA；因为高效包裹
细胞还没有开发，所以病毒颗粒的生产仍需花费心血；然而这些载体充满希望并呈现安
全。进一步认识到，虽然预期野型病毒再会从载体中失去，但AAV有能力整合进入非分离
细胞，而且以附加体状态保留直至细胞分离发生。
　　依据其它DNA病毒的载体
　　其它DNA病毒正在有可能为特殊情况当作基因治疗载体而研究。例如， 疱疹单一病
毒（HSV）载体有为神经系统及几种其它类型细胞传导细胞的自然倾向。HSV剥离下来的
部分叫amplicon,它具有一定的先进性，尤其是与其它病毒系统成分结合时，包括痘病毒
的大量DNA病毒正在研究中。几个研究人员正在考察病毒（DNA和RNA）的复制活性或被减
弱性。此外，杂交系统曾被报道，在这篇报道中，腺嘌呤病毒通常把逆转录病毒导入不
能正常达到逆转录病毒传导的细胞中。
　　非病毒载体
　　虽然病毒系统是潜在的高效，但对将来作参考选择的非病毒基因输送系统提出两种
建议：安全，制造方便。能设计出全部合成基因输送系统以避免产生结合病毒的危险，
或由生物活性病毒颗粒工程化的其它毒素效应。还有，生产成品产品不应该比想象中的
细菌那种组织细胞培养更复杂。QA/QC步骤应简单化。

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其实　我盼望的 也不过就只是那一瞬
我从没要求过　你给我 你的一生
如果能在开满了栀子花的山坡上 与你相遇　
如果能深深地爱过一次 再别离
那么　再长久的一生
不也就只是　就只是回首时 那短短的一瞬

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