Biology 版 (精华区)

发信人: cameran (竹晨), 信区: Biology
标  题: 杂交与结果的读出
发信站: 哈工大紫丁香 (2001年07月29日13:09:44 星期天), 站内信件


杂交与结果的读出
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　杂交条件的选择
　　杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步，其复杂的程度和具体条件的
控制由芯片中DNA片段的长短和芯片本身的用途而定。如果是表达检测，杂交时需要高盐
浓度、低温和长历时(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低。如果要检测是否有突变
，因涉及单个碱基的错配，故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂
交。
　　杂交过程并不是一个简单的、在液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链的反
应。影响杂交的因素很多，英国牛津大学Southem研究组发现，其中传阻因素的影响尤其
重要：合适长度的DNA片段可有利于探针与之杂交；DNA分子中任何带正电或负电的残基
都会影响杂交效率。另外，在有利于杂交双链形成的条件下，探针分子本身也有利于形
成自身双链的二级结构甚至三级结构，使靶序列不易被探测到。解决杂交中诸多问题的
最好方法就是用PNA代替DNA制成芯片。
PNA的结构及其优越性　
　　PNA是丹麦科学家Nielsen于1991年首先合成，其基本化学结构如图所示。PNA的骨架
由重复的N-(2-氨乙基)—甘氨酸通过酰胺键相连构成，碱基则通过甲叉碳酰基与骨架相
连。由于它不象DNA那样在核糖磷酸骨架中存在带负电的磷酸基团，因而杂交时不需盐离
子以抵消DNA链之间的静电排斥。这样DNA与PNA更易靠近而形成杂交分子，不会因静电斥
力形成自身二级、三级结构，并且形成的DNA-PNA杂交分子的稳定性和碱基配对的特异性
也大大提高。由于上述显著优点，虽然PNA的制造比DNA要麻烦一些，但仍大有取代DNA而
成为芯片制造的首选材料的趋势。
杂交图谱的检测和读出
　　目前，由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增
，不过也有不少人试图绕过这一问题，如Mosaic Technologies 公司引入的固相PCR方法
，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐；Lynx Therapeutics公司引入
的大规模并行固相克隆法(Massively parallel solid-phase cloning)，可在一个样品
中同时对数以万计的DNA片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
　　显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏度仍较低。目前
正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检
测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行
定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错
配碱基探针的5-35倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础[8]。但荧
光法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合
是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行
分辨。
　　对于以核酸杂交为原理的检测技术，荧光检测法的主要过程为：首先用荧光素标记
扩增（也可以有其它放大技术）过的靶序列或样品，然后与芯片上的大量探针进行杂交
，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步）这时，用落射荧光显微镜或
其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较。前已述及
，由于正常的Watson-Crick配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳
定性。所以，如果探针与样品分子在不位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同
，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原
理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以
至于分析结果不尽一致。
　　此外，人们正在研究多种替代方法，如：质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方
阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷变化检测等等。其中最有前途的当推质谱法，因为它
可以在各DNA方阵点上提供更多、更快、更精确的信息以供读出。用质谱法不仅可以准确
地判断是否存在基因突变，还可精确地判断它位于序列的哪一位置上。不过由于在探针
的化学合成上还存在一些问题，质谱法还不如荧光标记法用得普遍。
　　由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的
杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的
可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都
由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。
<-责任编辑：林郁->
　

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欲讯秋情众莫知, 喃喃负手叩东篱。
孤标傲世偕谁隐，一样花开为底迟？
圃露庭霜何寂寞，鸿归蛩病可相思？
休言举世无谈者，解语何妨片语时。

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