Biology 版 (精华区)

发信人: cameran (竹晨), 信区: Biology
标  题: 原位合成法
发信站: 哈工大紫丁香 (2001年07月29日13:11:58 星期天), 站内信件

原位合成法
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　原位光控合成(light-directed synthesis)
　　寡核苷酸的原位光控合成技术是由Affymetrix公司开发的，它是利用固相化学(sol
id phase chemistry)、光敏保护基(photoliabile protecting groups)及光刻技术(ph
otobithography)得到位置确定、高度多样性的化合物集合，由这种方法得到的芯片通常
称为GenechipTM。该法中，光敏保护基用于保护碱基单位的5’羟基；合成的第一步是利
用光照射使固体表面上的羟基脱保护，然后，固体表面与光敏保护基保护、亚磷酰氨活
化的碱基单体接触，合成只在那些脱去保护基的地方发生。光照区域就是要合成的区域
，该过程通过一系列的掩盖物(mask)来控制。在玻璃片上进行32步化学反应，就可能得
到所有65536个不同的8nt寡核苷酸。这种方法可以使每cm2上的探针数量达106个，每种
探针为5-10um的方形区域，探针的间距约为20um， 这种方法的最大优点就是在一个较小
的区域可以制造大量不同的探针，如：1 cm2可以有400,000种探针。目前Affymetrix公
司已有同时检测6,500个已知人类基因的基因芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000
个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。已有用于检测艾滋病病毒基因、乳腺癌、卵巢癌
等疾病相关基因及监控药物代谢的CY450等多种基因芯片。
　　但是，基因芯片的这种制备方法需要预选设计、制造一系列掩盖物，造价较高；制
造过程中采用光脱保护方式，掩盖物孔径较小时会发生光衍射现象，制约了探针密度的
进一步提高，而且光脱保护不彻底，每步产率只有92-94%，因此这种方法只能合成30nt
左右的寡核苷酸探针，同时探针区域由于存在大量不成功的合成片段，造成杂交背景较
高，不适于定量检测。其次，对研究者而言，每次实验只是使用商品化芯片探针中的一
部分，探针浪费较为严重。
　　McGall将光控合成技术与半导体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为脱保护
剂，每步产率可达98%，解决了光由于衍射造成脱保护不彻底及对DNA点阵密度的制约。
目前可以制备探针大小为 8um的方形区域的基因芯片，预计可以将每种探针区域降低为
1um ，这样就可以制备每平方厘米1010种探针的高密度基因芯片。
原位标准试剂合成
　　DNA还可像CPG(controlled pore glass)珠上一样， 在玻璃片上进行原位合成。最
初原位合成是手工完成的，最近，已发展到可自动完成这一过程；通过六聚乙二醇及伽
玛环氧丙基三甲氧基硅烷(glycidpxypropyltrimethoxylsilane)在玻璃上产生烷基伯羟
基，利用Applied Biosystem 381A合成仪用标准试剂进行合成，环形及菱形反应室确定
碱基连接的位置，随着环形及菱形反应室在玻片上移动，在不同的区域就合成了不同的
探针。这种方法制备的寡核苷酸芯片已有应用的实例。
　　压电印刷法主要是美国加州Incyte Pharmaceuticals公司和Protogen公司所采用，
其原理类似于目前所用的喷墨打印机：打印机头在方阵上移动，在方阵每点上电流使喷
头放大，并将装有某种碱基的试剂滴出1μl到晶片表面，然后固定。在洗脱和去保护后
，另一轮寡核苷酸的延伸就可继续进行。这种合成方式的各步收率超过常规的多孔玻璃
(controlled pore glass, CPG)合成法，一次可以合成40～50个碱基长度的寡核苷酸。
大量的寡核苷酸就可构成方阵。压电印刷法由于不需要与载体表面直接接触，故有很高
的效率，但制造工艺还不太成熟。

<-责任编辑：林郁->

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欲讯秋情众莫知, 喃喃负手叩东篱。
孤标傲世偕谁隐，一样花开为底迟？
圃露庭霜何寂寞，鸿归蛩病可相思？
休言举世无谈者，解语何妨片语时。

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