Biology 版 (精华区)

发信人: cameran (竹晨), 信区: Biology
标  题: DNA芯片技术要点
发信站: 哈工大紫丁香 (2001年07月29日13:13:14 星期天), 站内信件

DNA芯片技术要点
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　所有的DNA芯片技术都包含四个基本要点：DNA方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交
图谱的检测及读出。
DNA方阵的构建
　　目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处理片芯(玻璃片或硅片
），然后使 DNA片段或蛋白质分子按顺序排列在片芯上。因芯片种类较多，制备方法也
不尽相同，但基本上可分为两大类：一类是原位合成(in situ Synthesis)；一 类 是 
合 成 后 交 联(post-synthesis attachment)。原位合成适用于寡核苷酸；合成后交联
多用大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。
·原位合成(in situ Synthesis)
　　原位合成是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法，主要有光控合成法和原
位标准试剂合成法两种途径。光控法每步缩合率较低，一般为92%-94%左右，合成30m的
产率仅 20%；原位标准试剂法不需要特殊合成试剂，可以合成40-50m的寡核苷酸探针。

·合成后交联比原位合成简单，利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cD
NA样品点在经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可，主要用于诊断、检测病原体及其它
特殊要求的中、低密度芯片的制备。
样品DNA或mRNA的制备
　　生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与
芯片反应，必须将样品进行生物处理。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成
为探针以前必须扩增以提高阅读灵敏度，但这一过程操作起来却有一定的难度。比如在
一个癌细胞中有成千上万个正常基因的干扰，杂合癌基因的检测和对它的高效、特异地
扩增就不是一件容易的事。因为在一般溶液中PCR扩增时，靶片段太少且不易被凝胶分离
，故存在其它不同的DNA片段与其竞争引物的情况。美国Mosaic Technology公司发展了
一种固相PCR系统。此系统包含两套引物，每套都可以从靶基因两头延伸。当引物和DNA
样品及PCR试剂相混时，如果样品包含靶序列，DNA就从引物两头开始合成，并在引物之
间形成双链DNA环或“桥”。由于上述反应在固相中产生，因而避免了引物竞争现象，并
可减少残留物污染和重复引发。
杂交
　　杂交是DNA芯片技术中除DNA方阵构建外最重要的一步，其复杂的程度和具体条件的
控制由芯片中DNA片段的长短和芯片本身的用途而定。如果是表达检测，杂交时需要高盐
浓度、低温和长历时(往往要求过夜)，但严谨性要求则比较低。如果要检测是否有突变
，因涉及单个碱基的错配，故需要在短时间内(几小时)、低盐、高温条件下高严谨性杂
交。
杂交图谱的检测和读出
　　目前DNA探针大多采用荧光标记法，并根据各杂交点的荧光信号强弱用扫描同焦显微
镜读出。它的优点是重复性好，缺点是灵敏度相对较低。为此，人们正在研究多种替代
方法，如：质谱法、化学发光和光导纤维、二极管方阵检测、乳胶凝集反应、直接电荷
变化检测等等。其中最有前途的当推质谱法，因为它可以在各DNA方阵点上提供更多、更
快、更精确的信息以供读出。用质谱法不仅可以准确地判断是否存在基因突变，还可精
确地判断它位于序列的哪一位置上。不过由于在探针的化学合成上还存在一些问题，质
谱法还不如荧光标记法用得普遍。
　　由于杂交时产生序列重叠，会有成百上千的杂交点出现在图谱上，形成极为复杂的
杂交图谱。序列重叠虽然可为每个碱基的正确读出提供足够的信息，可提高序列分析的
可靠性，但同时信息处理量也大大增加了。一般说来，这些图谱的多态性处理与存储都
由专门设计的软件来完成，而不是通过对比进行人工读谱。
<-责任编辑：林郁->
　
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欲讯秋情众莫知, 喃喃负手叩东篱。
孤标傲世偕谁隐，一样花开为底迟？
圃露庭霜何寂寞，鸿归蛩病可相思？
休言举世无谈者，解语何妨片语时。

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