Biology 版 (精华区)
发信人: zjliu (秋天的萝卜), 信区: Biology
标 题: 包涵体表达的蛋白的复性
发信站: 哈工大紫丁香 (Thu Apr 15 13:38:57 2004), 站内信件
包涵体表达的蛋白的复性
摘要 综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的
主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词 包涵体 蛋白质 复性
Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolati
on and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins an
d the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of
recombinant protein have been improved by using some additives, such as molec
ular chaperone, small molecules.
Key words inclusion body , protein , renaturation
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质
、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低
分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性
产率。
一、 包涵体：
1.1包涵体的定义、组成与特性：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 一般含有50%以上
标 题: Re: 蛋白复性
发信站: 饮水思源 (2004年04月13日09:55:06 星期二)
包涵体表达的蛋白的复性
摘要 综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的
主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词 包涵体 蛋白质 复性
Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolati
on and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins an
d the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of
recombinant protein have been improved by using some additives, such as molec
ular chaperone, small molecules.
Key words inclusion body , protein , renaturation
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质
、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低
分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性
产率。
一、 包涵体：
1.1包涵体的定义、组成与特性：
包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 一般含有50%以上
的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环
状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/
ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包
涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无
法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子
的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体
，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行
折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶
解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的
含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵
体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助
因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包
涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌
体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2]
1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致
的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环
状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/
ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包
涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1]
1.2包涵体的形成：
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无
法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子
的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体
，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行
折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶
解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的
含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵
体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助
因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包
涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌
体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2]
1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致
了包涵体的形成。
1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解
1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎
，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于
大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。
因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提
高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心
，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体
，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tr
is pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片
和膜蛋白。[3]
1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的
相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐
酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而
且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时
。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水
键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas
mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中
通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、
二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-
BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的
此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强
度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
2.2.2提高包涵体蛋白的复性产率
2.2.2.1氧化-还原转换系统
对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有：空气氧化法
、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT
/GSSG、DTE/GSSG等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反
应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1-3m mol/l还原型巯基试剂,还原型和氧化型
巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。[7]
2.2.2.2添加低分子化合物
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性
，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以
及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可
起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而
防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率
。浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如t-
PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短
的疏水集团组成，故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-1
95，NDSB-201，NDSB-256。[8]
2.2.2.3PEG-NaSO4两相法
此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强
度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
2.2.2提高包涵体蛋白的复性产率
2.2.2.1氧化-还原转换系统
对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。常用的方法有：空气氧化法
、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT
/GSSG、DTE/GSSG等也都有应用。氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反
应提高了正确配对的二硫键的产率。通常使用1-3m mol/l还原型巯基试剂,还原型和氧化型
巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。[7]
2.2.2.2添加低分子化合物
低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性
，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。如盐酸胍、脲、烷基脲、以
及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。蛋白质的辅因子、配基或底物亦可
起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而
防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率
。浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。成功的应用于很多蛋白如t-
PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短
的疏水集团组成，故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-1
95，NDSB-201，NDSB-256。[8]
2.2.2.3PEG-NaSO4两相法
用PEG和NaSO4作为成相剂,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行
复性,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。[9]
2.2.2.4分子伴侣和折叠酶等
这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、F
K506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和
聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。[13]
2.2.2.5其它
提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或
表面活性剂CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等对蛋白质复性有
促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可
以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。[10]
2.3复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效
率进行检测。
2.3.1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态
的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2.3.2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两
种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
2.3.3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
2.3.4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了
复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反
用PEG和NaSO4作为成相剂,然后加入盐酸胍，再把变性的还原的蛋白质溶液加入其中进行
复性,但这种方法需复性的变性蛋白质的浓度必须低。[9]
2.2.2.4分子伴侣和折叠酶等
这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白二硫键异构酶、肽酰-辅氨酰顺反异构酶、分子伴侣、F
K506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和
聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质的折叠复性。[13]
2.2.2.5其它
提高复性率的策略还有许多，如：非离子型去垢剂，尤其是离子型或两性离子去垢剂或
表面活性剂CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等对蛋白质复性有
促进作用；待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性；多聚离子化合物如肝素不仅可
以促进蛋白质的作用，而且具有稳定天然蛋白质的作用。[10]
2.3复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效
率进行检测。
2.3.1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态
的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2.3.2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两
种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
2.3.3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
2.3.4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了
复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反
ds of eukaryotic proteins expressed in E.coli as inclusion bodies. Biotech Bio
eng,1993,41(1)
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10 Lotwin J et al. Biotechnol & Bioeng, 1999,65(4)
11 de Bernardez C E. Refolding of recombinant proteins. Curr Opin Biotechnol,1
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d the recovery of active recombinant proteins fom E. Coli: to fold or refold.
Appl Biochem Biotechnol,1997,66(3)
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