Biology 版 (精华区)

发信人: zhili (北侠), 信区: Biology
标  题: 聚合酶链反应
发信站: 哈工大紫丁香 (Sat Nov 29 04:09:09 1997), 转信

 From: freeboy.bbs@bbs.sjtu.edu.cn (自由男孩儿)
 Date: 17 Jun 1997 11:52:52 GMT

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                      聚合酶链反应（ＰＣＲ）
 
                            ·方舟子·
 
     聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在
 短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。
 
 【开发史】
 
     这项技术的发明人是Kary Mullis。１９８３年，在一家生物高技术
 公司（Ｃｅｔｕｓ）工作的Mullis着手解决用简单的方法鉴定某一段ＤＮ
 Ａ的技术问题，有一天晚上他驱车在北部加州１０１号高速公路上，灵机
 一动想到了一个实际上可以无限扩增某段ＤＮＡ的简单方法，即ＰＣＲ。
 在１９８５年的一次学术会议上，此方法首次被介绍，在分子生物科学家
 中也引起了链反应。大家很快地纷纷采用这个方法，很多人还很奇怪自己
 怎么没有首先想到这么做。Ｃｅｔｕｓ给了Mullis一万美元的奖金，随后
 把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家生物高技术公司。在短
 短的几年内，ＰＣＲ迅速成为分子生物学的一项常规手段，并得到了广泛
 的实际应用，被许多科学家视为近十年来分子生物学领域最重要的一项技
 术突破。１９９３年，Mullis因此获得诺贝尔化学奖。
 
 【原理和方法】
 
     众所周知，ＤＮＡ是由四种碱基按互补配对原则（即腺嘌呤Ａ对胸腺
 嘧啶Ｔ，鸟嘌呤Ｇ对胞嘧啶Ｃ）组成的螺旋双链。在细胞内，ＤＮＡ复制
 时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，另一种酶－－
 ＲＮＡ聚合酶合成一小段引物（ｐｒｉｍｅｒ）结合到ＤＮＡ模板上，最
 后，ＤＮＡ合成酶以这段引物为起点，合成与ＤＮＡ模板配对的新链。Ｐ
 ＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮ
 Ａ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的
 两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。
 
     假定我们要研究的ＤＮＡ双链两端的序列是：
 
     TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
     ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
 
     在ＰＣＲ之前，我们首先人工合成两段有２０－３０碱基的引物，能
 够分别与上下两条链的一端配对，比如一条是（为与模板能够区别，以小
 写表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一条就是tttacggatcggcaacctat。
 把这两段引物和ＤＮＡ模板、ＤＮＡ聚合酶、底物（四种脱氧核苷）混合
 在一起，我们就可以开始做ＰＣＲ了。
 
     第一步叫“变性”，把样品加热到９４－９６摄氏度一到数分钟，让
 ＤＮＡ模板变性变成单链。
 
     第二步叫“退火”，让样品的温度下降到５０－６５摄氏度一到数分
 钟，引物就可以结合到模板上去。
 
     TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
     ataagcccgaaaggttcgtt
 
                                            tatccaacggctaggcattt
     ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
 
     第三步叫“延伸”，让样品的温度上升到７２摄氏度一到数分钟，Ｄ
 ＮＡ聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。
 
     TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT
     ataagcccgaaaggttcgttGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
 
     TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG...........GATCtatccaacggctaggcattt
     ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC...........CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA
 
     这样经过三步一个循环，一条双链就变成了两条，再来一个循环，就
 变成了四条……在一个由计算机控制的循环加热器上经过三十个循环，就
 可以把原来的样品精确地扩增了２的３０次方倍，而这只需要两三个小时。
 
     ＰＣＲ要成功，必须要有能够忍耐高温、在高温下仍然能有活性的Ｄ
 ＮＡ聚合酶。这种酶可从生活在温泉中的细菌中提取，其中最常用的一种
 叫Ｔａｑ聚合酶。野生型的Ｔａｑ聚合酶保真度较差，在复制比较长的模
 板时容易发生点突变。通过遗传工程，我们已获得了高保真度的Ｔａｑ聚
 合酶，大大提高了ＰＣＲ复制的精确程度。
 
 【应用】
 
     在分子生物学基础研究上，ＰＣＲ被广泛地用于基因克隆和制造突变。
 
     在临床医学上，ＰＣＲ被用于鉴别遗传疾病和快速检测病毒、病菌感
 染。用传统的方法，要检测病毒、病菌的感染需要把病原体培养数周才能
 鉴定，而现在用ＰＣＲ，即可以迅速判断人体细胞（比如血液细胞）中是
 否存在病毒、病菌的ＤＮＡ（比如ＨＩＶ的ＤＮＡ）而确诊。
 
     在法医上，ＰＣＲ目前已成为发现罪证的重要方法。比如，０·１微
 升的唾液痕迹所含的ＤＮＡ就可以通过ＰＣＲ扩增而获得足够量的ＤＮＡ
 进行测序鉴定罪犯。毛发、血迹、唾沫、精液因此都可以成为重要的罪证。
 
     利用ＰＣＲ技术，科学家们已从林肯的头发和血液、埃及的木乃伊、
 琥珀中八千万年前的昆虫、恐龙的骨头等不寻常的样品中提取了足够的Ｄ
 ＮＡ进行研究。博物馆中的化石标本都有可能成为遗传学的研究对象，一
 门分子古生物学因此诞生。
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