Biology 版 (精华区)

发信人: Ingrid (新世纪的灵儿), 信区: Biology
标  题: 基因的新功能及新基因的发现(5)
发信站: 紫 丁 香 (Mon Jan  3 21:03:17 2000), 转信


发信人: zel (雨), 
信区: biology
标  题: 基因的新功能及新基因的发现(5)

发信站: 饮水思源站 (Wed Dec 29 22:44:27 1999), 转信PART- B)

共生固氮作为发育生物学的良好模型并因为其在农业上的应用潜力
正得到广泛研究。其中的结瘤步骤由于与根瘤菌宿主范围的决定有
直接关系更倍受重视。结瘤过程中共生双方揪根瘤菌和豆科植物有
许多基因和信号参与。在八十年代从各种根瘤菌中综合使用遗传学、
分子生物学、生物化学以及计算机辅助分析等方法鉴定了大量的
结瘤基因(nod 或 nol或noe)，对这些基因的结构、功能和调控的研
究随后成为热点。功能研究目前仍然吸引着很多科学家。现在发现
大多数结瘤基因与结瘤因子的合成及外运有关。结瘤因子是三到六
聚的N-乙酰葡萄糖胺组成的寡糖，其还原和非还原端受到多种修饰。
不同的根瘤菌合成的结瘤因子具有一些独特的结构特征，因此被认
为是根瘤菌与宿主特异识别的主要信号。负责合成寡糖骨架的nodA,B,C
被称作通用结瘤基因，它们存在于所有已知根瘤菌中；负责添加修饰
基团的其它基因被称为宿主特异基因(如nodE,F)，它们只存在于某些
或某种根瘤菌株中(Denarie J et al. 1996)。目前已尝试从植物方面分离
结瘤因子的受体。总的来说，结瘤因子及其信号传导的知识近来
无论从广度还是深度上都有十分迅速的进展，但结瘤基因调控的研究
仍然占有重要的地位。通常绝大多数的结瘤基因在培养细菌中并不表
达。它们的启动需要调控基因nodD的产物NodD蛋白的激活。NodD是DNA
结合蛋白，它在各nod操纵子上游调控区域中有些高度保守的核苷酸，
称作nod box。在某些根瘤菌中NodD能够自身负反馈。同时NodD的激活
功能需要宿主植物根部分泌的诱导分子，主要是类黄酮类物质的存在。
由于不同植物分泌的类黄酮存在差别，而特定NodD只能响应特定类黄酮，
所以这一步也被作为根瘤菌与宿主特异识别的一个重要环节(Long SR.1996)。
最初只发现NodD-类黄酮的组合有调控功能，后来又揭示了其它一些调控
方式的存在。在慢生型根瘤菌B. japonicum中发现了nodW, nol
A。前者与原核生物中常见的二组分信号系统的反应调控蛋白相似；
后者是nod基因的负调蛋白。而在快生型根瘤菌中，先是发现某些种
类如R. meliloti有多个nodD等位基因，它们识别不同的类黄酮分子
甚至完全不依赖诱导物；后来在R. meliloti中又确认了nodD的同源
基因syrM, 它与nodD3形成正激活回路。再后在R. meliloti 和R. l
eguminosarum bv. viciae中发现了细菌染色体上存在调控基因。这是
一个观念上的突破，因为以前发现的快生型根瘤菌的结瘤基因都
位于其中的一个称作Sym的巨大质粒上，当时许多科学家认为结瘤和
根瘤菌的染色体无关(van Rhijn P and Vanderleyden J. 1995)。
已知的染色体上的调控基因是R. meliloti中的nolR和groELc, R.
leguminosarum bv. viciae 中的dctB。nolR是一分子量为13,349
的DNA 结合蛋白，负调nod基因的表达。其作用机制可能是干扰RNA
聚合酶与启动子的结合并降低NodD的胞内水平(Kondorosi et al.1
991)。最近发现它对通用结瘤基因操纵子和其它操纵子存在不同的
调控(Cren et al.1995)并进而影响结瘤因子的产量和结构。groEL
c是E. coli中分子伴侣GroEL (hsp60) 基因的同源基因，其突变使
NodD不能结合DNA从而丧失激活功能(Ogawa and Long, 1995)。dctB
对nod基因表达影响的机理还不清楚，但也可能与降低NodD胞内水
平有关。dctB对结瘤的影响只在它的一个特定位点突变株中观察到
(Mavridou et al. 1995)。
1987年洪国藩等在发现NodD蛋白是DNA结合蛋白，能与nod启动子DNA
形成核酸蛋白复合物的研究中，发现了一条不依赖于NodD的核酸蛋
白复合物条带。近来洪国藩组对其中的蛋白成份（简称Px）作了进
一步研究，并已初步探明Px由根瘤菌染色体编码。
近年来植物新基因的研究十分迅速，新基因不断有发现，在植物抗
病、抗虫、抗除草剂和改良植物某些组分的方面也获得不少转基因植株。
下面对一般常用和较新的植物基因分离方法略举几种：(1) 功能克
隆(functional cloning)，即以蛋白质特殊功能为前提
的克隆方法，也是基因克隆中最早采用的策略。它以功能蛋白质纯
化或表型突变互补型蛋白质的分离为基础的基因分离方法。前几年
我们分离的慈菇蛋白酶抑制剂基因，就是根据该抑制剂一级结构顺
序，应用PCR技术而获得的。 随着蛋白质分离纯化和序列分析技术
的发展，此方法将继续可发挥其在新基因分离中的重要作用。(2) 
mRNA差异显示法( differential display ), 它是以基因特异
性表达为前提的克隆基因的方法。可在不同条件下生长的植物，不
同发育时期及不同组织、器官的样品中提取mRNA后，反转录合成cDNA
探针，与cDNA文库或基因文库杂交，从而分离基因。(3)转座子标
签法 ( transposon tagging ), 是以转座子插入所需
要分离的基因，从而引起基因插入失活而产生突变的原理。根据突
变体的表型变化，用转座子DNA为探针，从基因文库中分离目的基因
的方法。用该法已从玉米中克隆到HM1基因，对Cochliobolus Carbomum
有抗性，从烟草中获得N基因抗烟草花叶病毒，从亚麻中分离到
抗锈病的L6基因，以及从蕃茄中获得了抗Cladospeerium fulvum的cf 
9基因。基于外源DNA插入的诱变分离基因的方法，还有T-DNA标签法等都是
很有前途的技术。但对控制数量性状的基因还是有困难的。
(4)图位克隆( map-based cloning )分离基因方法：是根据染色体
连锁图上RFLP (RAPD,AFLP )等探针所标示的控制某一表型性状的基因位
置，借助大分子DNA克隆(YAC,BAC )与染色体步移法，分离与克
隆目的基因区段。图位克隆在植物上最早最为成功的例子是从拟南芥
菜中分离到了w-3去饱和脂肪酸酶基因(fad3)。
1993年Martin,G.B等报道从蕃茄中获得Pto基因,1994年Mindrinos,M,
等从拟南芥菜中获得RPS2基因，它们都能抗各种的Pseudomonas syri
ngae. 1995年Wen-Yuan Song等成功地用图位克隆方法分离到了水稻抗
百叶枯基因Xa21。
　　其它还有核DNA减法(genomic substraction )等方法进行基因的分
离。总之，在植物新基因的分离研究中，目前发展的技术不断地增
多，包括许多分子标记（RFLP,RAPD,AFLP,ISSR )可作为基因分离中
高密度DNA的连锁指示。特别最近洪国藩的高覆盖水稻基因组物理图
的发表，将对水稻和其它禾本科作物新基因的分离起十分重要的作用。

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※ 来源:．紫 丁 香 bbs.hit.edu.cn．[FROM: mu.hit.edu.cn]