Biology 版 (精华区)

发信人: Ingrid (新世纪的灵儿), 信区: Biology
标  题: 基因的新功能及新基因的发现(6)
发信站: 紫 丁 香 (Mon Jan  3 21:11:20 2000), 转信


发信人: zel (雨), 
信区: biology
标  题: 基因的新功能及新基因的发现(6)
发信站: 饮水思源站 (Wed Dec 29 22:50:04 1999), 转信
1、主要研究课题和内容(1)结瘤调控新因子
将以Px的发现为契机，运用生化手段，筛选并确定参与根
瘤菌结瘤基因调控的新基因，展开基因结构与功能的研究；
再结合RNA聚合酶、NodD、类黄酮和启动子DNA在结瘤基因
调控中的作用的研究，揭示结瘤调控的新机制。主要将研
究：a. Px的纯化和基因克隆；px基因突变及对结瘤基因
表达的影响；px基因突变对结瘤固氮的影响；Px与NodD和
RNA聚合酶的相互作用。Px蛋白与结瘤基因启动子能够发生
相互作用，提示它可能参与结瘤调控。以往发现的染色体
编码的结瘤调控蛋白NolR, GroELc, DctB,基本上都是通过
遗传方法鉴定的。而Px首先根据其生化性质发现，我们准
备先纯化蛋白，而后测定蛋白末端氨基酸顺序，设计引物，
制备杂交探针，从基因组文库中钓取其基因。蛋白的纯化和文库的
建立都已经在进行。获得px基因后，可以进行两方面的工
作。第一，高效表达Px蛋白， 研究它与NodD 和RNA聚合酶
的相互作用，主要方法是凝胶延滞，足迹保护和体外转录等；
第二，构建px突变质粒，转入根瘤菌，通过同源重组产生带
有突变的px基因的菌株。此时， 首先引入结瘤基因启动子
与lacZ融合的报道基因，观察px突变对结瘤基因转录的影
响；而后，以px突变的菌株接种宿主植物，通过与
野生型相对照，观察它对根瘤菌结瘤固氮效率的影响。
b.研究NodD与GroEL的联系是否与根瘤菌的生长时相有关。
NodD的invivo 足迹保护研究。221组以凝胶延滞，足迹保
护和体外转录等手段研究了R. leguminosarum bv. viciae
中NodD自身负反馈和激活其它基因表达的机理。对
于自身负反馈，目前的推论是由于NodD和RNA聚合酶直接竞
争DNA上的结合位点引起的；对于激活机制，还需做深入研
究。我们已经发现，NodD是以蛋白复合体的形式与nod box
结合的。曾经发现部分纯化的NodD中富含GroEL同源蛋白，
但有些时候则没有，我们推测它们之间的联系是否与根瘤
菌的生长时相有关，我们准备制备不同生长时相的根瘤菌，
利用免疫共沉淀的方法研究这个问题。利用DMS或UV进行
in vivo足迹保护实验，以确认NodD在细菌生活状态时活体
中与DNA相互作用的情况，从而进一步将体内体外的结果联
系起来。c.发展筛选新调控基因的技术，丰富检测手段。转
座子突变筛选基因。根据DNA结合活性探测可能的新蛋白，
目前已注意到NodD和PX与nod启动子的复合物外还有另外的
复合物。根据对体外转录的影响探测可能的新蛋白。为体外
系统的建立提供了条件。d.继续对新的RNA聚合酶s 亚基的探查。
我们现在用于体外转录的RNA聚合酶所包含的s 亚基主要是
与E. coli 的s 70同源的(亚基。这种全酶能够在体外特异起始nodD
基因的转录， 但是，体外转录其它结瘤基因的实验未能得
到非常明确的结果。作为改进，一方面我们在寻找新的调控
蛋白；另一方面，我们也试图了解是否存在结瘤特异的RNA
聚合酶的s 亚基，作出这样的推测是合理的，因为固氮基因
就是由含特异的s 54亚基的RNA聚合酶转录的。考虑到替代
型的s 亚基的胞内含量一般较低，我们正在建立豌豆根瘤菌
的表达文库，希望利用核酸探针或抗体
筛选有关的(基因，高效表达后用于转录研究。e.根据系统
缺失的结果，利用顺式元件中确定的功能亚区，寻找新的结
瘤调控因子。
在进行启动子的系统缺失时，根据缺失突变株lacZ活力的
变化以及该变化是否与NodD有关，推测存在另外一些调控
因子。比如，从结瘤基因nodA方向开始缺失突变的nodD启
动子活力分析表明，iv-v区有很强的抑制效应，并且这种
抑制与NodD蛋白无关，可能是由另外的调控因素引起的。

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※ 来源:．紫 丁 香 bbs.hit.edu.cn．[FROM: mu.hit.edu.cn]