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发信人: zjliu (秋天的萝卜), 信区: NanoST
标  题: 原子力显微镜及其在生物学研究中的应用(转载)
发信站: BBS 哈工大紫丁香站 (Sun Apr 10 12:53:19 2005)

摘要

原子力显微镜自从问世以来在生物学研究中有其不可替代的作用，是生命科学研究中不
可缺少的工具。原子力显微镜(AFM)技术本身有许多优势，如样品制备简单，可在多种环

境中运作，高分辨率等等。本文主要从生物化学、细胞生物学、免疫学和物质超微结构
研究等几个方面对其在生物学中的应用进行综述。

关键词：原子力显微镜 探针 RNA聚合酶 分子间相互作用



原子力显微镜(AFM)的优势

原子力显微镜(AFM)是80年代初问世的扫描探针显微镜(scanning probe microscope，SP

M)的一种。1986年，Dr. Binning因发明扫描探针显微镜而获得诺贝尔物理奖。这种显微

镜的放大倍数远远超过以往的任何显微镜：光学显微镜的放大倍数一般都超不过1000倍
；电子显微镜的放大倍数极限为100万倍；而原子力显微镜的放大倍数能高达10亿倍，比

电子显微镜分辨率高1000倍，可以直接观察物质的分子和原子，这为人类对微观世界的
进一步探索提供了理想的工具。

原子力显微镜(AFM)本身的优势是其在生物学中得以迅速发展的主要原因。首先，原子力

显微镜(AFM)技术的样品制备简单，无需对样品进行特殊处理，因此，其破坏性较其它生

物学常用技术(如电子显微镜)要小得多；第二，原子力显微镜(AFM)能在多种环境(包括
空气、液体和真空)中运作，生物分子可在生理条件下直接成像，也可对活细胞进行实时

动态观察；第三，原子力显微镜(AFM)能提供生物分子和生物表面的分子/亚分子分辨率
的三维图像；第四，原子力显微镜(AFM)能以纳米尺度的分辨率观察局部的电荷密度和物

理特性，测量分子间(如受体和配体)的相互作用力；第五，原子力显微镜(AFM)能对单个

生物分子进行操纵；另外，由原子力显微镜(AFM)获得的信息还能与其它的分析技术和显

微镜技术互补。

原子力显微镜(AFM)还具有对标本的分子或原子进行加工的能力，例如，可搬移原子，切

割染色体，在细胞膜上打孔等等。综上所述，原子级的高分辨率、观察活的生命样品和
加工样品的力行为成就了原子力显微镜的三大特点。

原子力显微镜(AFM)原理

原子力显微镜(AFM)通常使用氮化硅作为一个灵敏的弹性微悬臂,在其尖端有一个很尖的
探针用来在样品上扫描。点状物或原子之间的相互作用力通常用Lennard-Jone电位描述:

U(r)=-U0[(r0/Z)12-(r0/Z)6]此处Z为原子间距,U0和r0分别为平衡状态下原子间的能量
和距离。当原子间距小于r0时，原子间作用力由吸引力变为排斥力。探针与表面之间的
吸引力和排斥力被用于扫描力试验。不同表面方位的探针作用力给出关于表面形态和一
些其他表面特征的信息。原子力显微镜(AFM)有两种类型：接触式和非接触式,分别基于
排斥作用和吸引作用。原子力显微镜(AFM)试验中,探针尖端近似为显微球,则针尖与样品

表面间的作用力为:F(Z)=2πR0B/3Z3其中Z为针尖与样品之间的距离,R0为近似显微球针
尖的半径,B为一个与物体介电常数有特殊关系的常量。原子力显微镜(AFM)探针安装在一

个灵活的悬臂上,激光二极管发出的一束激光经悬臂反射后,打在一个分裂式光电二极管
上,当探针在样品表面扫描时,由于样品表面原子结构起伏不平,悬臂也就随之起伏,于是
激光束的反射也就起伏。光电二极管将其接收、放大,即可获得样品表面凹凸信息的原子

结构图像。原子量级的表面形态记录是原子力显微镜(AFM)特有的性能。

轻敲模式(Tapping Mode, TM)成像技术在用原子力显微镜(AFM)观察柔软、粘连、易碎的

样品方面,TM成像术的出现是一个关键性进步。TM-AFM在空气中扫描时，探针通常以5000

0～500000次/秒的频率交替接触和离开表面。由于针尖接触表面造成能量损失，悬臂振
荡减弱,这种振幅的减小可以用来鉴别、测量表面状态。当针尖通过表面隆起部分时，悬

臂在较小空间内振荡，振荡的振幅同时变小;相反,当针尖通过凹陷处时,悬臂在较大范围

振荡,振幅变大。数字反馈回路用来

调整针尖-样品间距以维持恒定的振幅和作用于样品上的力。TM-AFM在液体媒质中扫描时

,为了避免使整个液体细胞在悬臂振荡驱使下进入上下运动状态, 必须选择一个合适的振

荡频率(通常在5000～40000次/秒的范围内)。这种方法的特点是：当针尖沿X方向进行扫

描时，周期性的使针尖在Z方向上撤离样品表面然后再接近，并保持每次撤离的距离相等

，如果针尖撤离足够远，那麽针尖对样品的横向作用力就不会被累积，从而可减少针尖
对样品的破坏作用。TM-AFM成像的优点在于,它既可以防止针尖与表面粘连和扫描过程中

造成的样品破坏,又能接触表面并获得高分辨图像。而且TM-AFM成像具有广阔的线性范围

,允许常规样品的重复测试。

使用原子力显微镜(AFM)观察生化过程

随着样品处理技术在液体中成像技术的改善,应用原子力显微镜(AFM)观察复杂的生化过
程成为可能。转录过程是基因表达的中心环节,而使用原子力显微镜(AFM)观察蛋白质和D

NA的相互作用存在一个矛盾要解决:生物分子需要固定到基底上是原子力显微镜(AFM)的
成像基础,而生化反应过程却需要生物分子能相对自由地移动。即使在大量非特异性DNA
存在时,RNA聚合酶(RNAP)与启动子间仍存在很高的结合率,人们猜想RNAP沿着DNA的扩散
是其原因之一。非特异性复合物在适当条件下沉积后,利用原子力显微镜(AFM)可观察到R

NAP沿着DNA滑动,且能在不同的DNA片段间转移。然而加入肝素可终止这些过程,这就进一

步证实了RNAP- DNA相互作用的非特异性。原子力显微镜(AFM)还能对转录的过程进行实
时观察，在加入核苷酸后,沉积到云母上的延长复合物沿着DNA模板单向移动。两个对照
实验证实RNAP与DNA的相对移动与转录的实际情况相符。在一个对照中,以没有终止子的
微环DNA作为模板,在云母上进行转录。在干燥后通过原子力显微镜(AFM)可观察到合成的

ＲＮＡ长链。在第二个对照中,DNA在相同的条件下,在云母上进行转录。不同的是加入的

核苷酸用32Ｐ标记。通过PAGE对反应产物进行分析,结果显示与云母结合的复合物具有活

性,而且转录的速度与用原子力显微镜(AFM)测得的近似生物分子的构象改变也是原子力
显微镜(AFM)的重要观察内容。将尿素酶沉积到云母上并用原子力显微镜(AFM)扫描,在液

池中加入尿素后发现,悬臂的垂直波动明显增加,这提示由酶活动引起的构象改变能直接
通过原子力显微镜(AFM)记录下来。格兰阴性菌的外膜是其保护屏障,它由规则组装的蛋
白质通道构成。其中研究较多的是Deinococcusradiodurans的六角形组装中间体(hexago

 nallypacked intermediate, HPI)蛋白。HPI被认为与营养的摄入和代谢物的排出有关
。HPI的原子力显微镜(AFM)图像显示了规则的六角形及中央的孔样结构。在液体中成像
则发现HPI呈现出“开和“关”两种不同的构象。意义虽不清，但这却显示出原子力显微

镜(AFM)在液体中成像的优势。 原子力显微镜(AFM)在研究分子识别中的应用分子间的相

互作用在生物学领域中相当普遍,例如受体和配体的结合,抗原和抗体的结合,信息传递分

子间的结合等,是生物体中信息传递的基础。原子力显微镜(AFM)可作为一种力传感器来
研究分子间的相互作用。这是由于原子力显微镜(AFM)理论上能感应10-14Ｎ的作用力,能

感应0.01ｎｍ的位移,而接触面积可小到10ｎｍ2。因此,原子力显微镜(AFM)被用于研究
互补的DNA链间、细胞粘附分子间及配体-受体间的相互作用力。生物素(biotin)和抗生
物素蛋白链菌素(streptavidin)间有高亲和力,其相互作用的热力学数据也较为清楚。因

而,生物素和抗生物素蛋白链菌素是原子力显微镜(AFM)测定特异相互作用力的良好典型
。在一经典实验中,用生物素化的小牛血清白蛋白(biotinlated bovine serum
albumin,BBSA)包裹微球,而微球连在悬臂上形成BBSA功能化探针。然后在有生物素阻断
和无生物素阻断的抗生物素蛋白链菌素溶液中测量BBSA功能化探针和BBSA包裹云母间的
粘附力。结果显示,无生物素阻断的抗生物素蛋白链菌素溶液中需要较大的力才能将BBSA

功能化探针与云母表面分离,力的大小为(0.257±0.025)ｎＮ,与分离配体-受体所需的力

相符。而在此基础上可推算出其有效的断裂距离为(0.95±0.10)ｎｍ。因此,当针尖包裹

了特定的分子(如生物素)后,通过针尖和样品间的相互作用可用于辨认表面的相应分子(
如抗生物素蛋白链菌素)的位置。现在已出现了商用的修饰探针,这些探针包裹了不同的
分子,可用于不同用途的分子识别。因而原子力显微镜将发挥更广泛的作用。 原子力显
微镜(AFM)在物质超微结构研究中的应用 原子力显微镜(AFM)可以直接观察到表面缺陷、

表面重构、

表面吸附体的形态和位置、以及有表面吸附体引起的表面重构等。原子力显微镜(AFM)可

以观察许多不同材料的原子级平坦结构，例如，可以用原子力显微镜(AFM)对DL－亮氨酸

晶体进行研究，可观察到表面晶体分子的有序排列，其晶格间距与X射线衍射数据相符。

另外原子力显微镜(AFM)还成功地用于观察吸附在基底上的有机分子和生物样品，如，三

梨酸、DNA和蛋白质的表面。海藻酸聚赖氨酸海藻酸(Alginate Poly L-Lysine
Alginate,简称APA)胶囊薄膜具有半渗透性,构成可以阻止人体免疫系统的成分进入由APA

薄膜构成的胶囊,从而使得胶囊内的物质免受免疫系统的侵害。因此,可采用该薄膜胶囊
保护人体内移植的组织,延长其在人体内的存活时间。同时,对药物具有缓释效应。APA薄

膜的半渗透性同其表面的超微结构有着密切的联系,研究其表面的超微结构对其半渗透性

的研究具有重要的意义。已有文献报道了关于采用原子力显微镜(AFM)对APA薄膜的表面
结构进行研究的内容,发现了APA表面的特殊结构，从而揭示了APA表面超微结构对半渗透

性的重要意义。目前,利用原子力显微镜(AFM)已获得了DNA、透析薄膜、烷烃分子、脂肪

酸薄膜以及多糖等的超微结构的图象。

原子力显微镜(AFM)在细胞生物学中的应用

应用原子力显微镜(AFM)可研究活细胞或固定细胞如红细胞、白细胞、细菌、血小板、心

肌细胞、活肾上皮细胞及神经胶质细胞的动态行为。原子力显微镜(AFM)对体外动态细胞

的分析具有非凡的能力。这些研究大都把样品直接放置在玻片上,不需要染色和固定,样
品制备和操作环境相当简单。用免疫胶体金标记细胞膜则打开了细胞表面抗原高分辨定
位之门。原子力显微镜(AFM)细胞成像如:用原子力显微镜(AFM)研究活肾上皮细胞,可在
浆膜小斑上以50nm的分辨率观察细胞骨架元素、浆膜浅凹和膜结合丝。用原子力显微镜(

AFM)观察血小板的运动,可看到微丝结构、颗粒传输到细胞质外侧及活化中细胞成份的再

分配。游走上皮细胞的浆膜可用原子力显微镜(AFM)实时成像。用原子力显微镜(AFM)以5

0nm的分辨率可观察水中活的或固定的哺乳动物细胞表面骨架结构,在活细胞中可及时跟
踪细胞构形的变化,引入药物(秋水仙素)导致的细胞骨架结构表面受体交联(通过IgE抗体

与IgE受体结合)等,还可描述细胞骨架力的变化。Parpura等用原子力显微镜(AFM)观察神

经元和神经胶质细胞在活体状态下质膜下微丝的运动,由于图像具有直观、实时、动态的

特点,从而提出了纳米外科学的概念,即对细胞进行纳米级的人工操作,以达到对病理细胞

进行“手术”的目的。 应用前景 原子力显微镜(AFM)技术在生物学领域的应用有赖于样

品制备方法和适合针尖-样品相互作用的缓冲液的研究。原子力显微镜(AFM)现已成为一
种获得样品表面结构高分辨率图像的有力工具。而更为吸引人的是其观察生化反应过程
及生物分子构象变化的能力。因此,原子力显微镜(AFM)在生物学领域中的应用前景毋庸
置疑。而对于原子力显微镜(AFM)技术本身,以下几个方面的进展将更加有利于它在生物
学中的应用。大多数生物反应过程相当快速,原子力显微镜(AFM)时间分辨率的提高有助
于这些过程的观察。生命科学研究有其自身特点,需设计出适合生物学研究的原子力显微

镜(AFM)。高分辨率是原子力显微镜(AFM)的优势。其分辨率在理论上能达到原子水平,但

目前还没有实现,如何作出更细的针尖将有助于其分辨率的进一步提高。而随着样品制备

技术的完善,原子力显微镜(AFM)必将成为生物学领域中一种常规的研究工具。





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感谢作者：北京大学血液流变学研究中心 许晓风
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